Nitric oxide sensing mechanisms of transcriptional regulators NsrR and RpoS in Salmonella enterica serovar Typhimurium

Abstract

환경에서 질소의 생태주기는 항균성 라디칼 산화 질소 (NO)의 생성을 포함한다. NO 는 생명 시스템을 포함한 생태계에서 주로 산소분자와 화학 및 생물학적 반응에 의해 반응성 질소 종 (RNS)의 생성을 추가로 매개 할 수 있다. 이는 핵산, 지질, 단백질 및 저 분자량 티올 화합물을 비롯한 다양한 박테리아 거대 분자를 불활성화시켜 궁극적으로 비정상적인 대사 및 정균작용을 유발한다. 동물숙주에서 식세포의 inducible NO synthases (iNOS)는 미생물 감염에 반응하여 세포 독성 수준의 NO 를 생성한다. 따라서 감염성 박테리아는 성공적인 발병을 위해 NO 와 활성질소종에 적응하고 저항해야 한다. 질산화적 스트레스에 대항하여 많은 박테리아는 NO 를 약한 독성 분자로 대사하는 플라보헤모글로빈 Hmp 를 암호화하는 hmp 유전자를 보존 한다. 그리고 여러 병원체의 독성을 위해 Hmp 발현이 요구되는 것으로 입증되었다. 음성 전사 조절 인자 NsrR 은 많은 Hmp- 발현 박테리아에서 보존되어왔다. Free iron 이 증가하는 상황에서 NsrR 에 의한 hmp 의 전사 조절은 박테리아에게 매우 중요하다. NO 가 없을 때 hmp 과발현은 박테리아에서 펜톤-매개 산화 손상을 강화시킬 수 있기 때문이다. 그러나, 장내 세균에서 hmp 전사에 대한 NsrR- 의존적 조절은 분자적으로 잘 알려지지 않았다. 또한, Hmp 발현은 감염 단계 (급성 vs 지속성)에 따라 박테리아 독성에 차등 적으로 기여하는 것으로 보고 되었으며, 이는 동물 세포에서 NO- 매개 반응에 의해 생성 된 활성질소종이 플라보헤모글로빈의 단독 기능에 의해 거의 해독 될 수 없음을 시사한다. 박테리아가 RNS 해독을위한 추가 유전자 조절 시스템을 작동시키는 지에 대한 의문이 제기되어왔다. 이 논문에서는 stationary-phase sigma factor RpoS 를 활성질소종에 대한 박테리아 반응에서 유전자 전사에 대한 잠재적 인 조절자로 예상하였다. Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium)을 모델 균주로 사용하여, 본 연구는 NO 를 감지하고 표적 유전자의 전사를 조절하는 NsrR 및 RpoS 의 분자 메커니즘을 이해하는 것을 목표로 하였다. 첫 번째 장은 hmp 전사 조절에있어서 NsrR 의 분자 특성을 제공하였다. S. Typhimurium 에서 NsrR 의 Val-43 잔기는 NO 에 노출 된 S. Typhimurium 에서 NO 소비 속도, 성장속도 및 hmp 의 전사를 조절하는 hmp 프로모터와 상호작용하기 위한 NsrR 의 중요한 아미노산 잔기로 확인되었다. 또한 다른 문(phyla)에서 박테리아로부터 NsrR 의 DNA 인식나선의 motifs 의 heterogeneous 아미노산 잔기는 다양한 NO 조건에서 박테리아 ecological niches 와 관련될 수 있음을 제안하였다. 두 번째 장에서, stationary-phase sigma factor RpoS 의 역할 및 살모넬라 RNS 반응에서 RpoS 와 그 어댑터 단백질 RssB 사이의 상호 작용을 연구하였다. 활성질소종에 의한 RpoS 의 증가 및 RpoS-의존적 활성질소종 반응 유전자의 전사는 활성질소종을 생성하는 산성화 된 아질산염 함유 배지에서 살모넬라 생존에 필요하여, NO- 의존적 방식으로 마우스에서 살모넬라 독성을 촉진시킨다. RNS 에 노출 된 S. Typhimurium 에서 RpoS 의 증가는 주로 정상적인 성장 조건하에서 RpoS 를 ClpP 및 ClpX 프로테아제 복합체로 전달하는데 필요한 adaptor protein RssB 의 활성질소종에 의한 비활성화에 의한 것이다. 요약하면, S. Typhimurium 에서 NO 해독 및 RNS 저항에 필요한 유전자의 전사를 조절하는 2 개의 조절 단백질의 분자 특성 분석을 S. Typhimurium transcriptome, NO / RNS 생화학, 단백질 정보학 및 마우스 감염을 포함한 분석을 통해 연구를 진행하였다. 연구 결과 박테리아가 NO 를 감지하는 방법과 NO 스트레스 하에서 박테리아의 적응에 중요한 유전자를 대상으로 이 신호를 전달하는지 밝혔다.|Ecological cycles of nitrogen in environment include production of the antimicrobial radical nitric oxide (NO). NO can further mediate the production of reactive nitrogen species (RNS) by chemical and biological reactions mostly with oxygen molecules in ecosystems including life systems, which inactivate various bacterial macromolecules including nucleic acids, lipids, proteins, and small molecular weight thiol compounds, ultimately causing abnormal metabolism and consequent bacteriostasis. In animal hosts, inducible NO synthases in professional phagocytes, in response to microbial infections, produce cytotoxic levels of NO, thus infectious bacteria must adapt and resist to NO and RNS for their successful pathogenesis. Against nitrosative stresses, many bacteria have evolutionally conserved hmp gene encoding the flavohemoglobin Hmp that metabolize NO inside bacteria to less toxic molecules. And Hmp expression has been proved to be required for the virulence of several pathogens. A negative transcriptional regulator NsrR has also been conserved in many of Hmp-expressing bacteria. In circumstances of increasing cellular free iron, the tight regulation of hmp transcription by NsrR is highly important for bacterial fitness because Hmp overexpression, in the absence of NO, can potentiate the Fenton chemistry-mediated oxidative damages in bacteria. However, molecular details on the NsrR-dependent regulation on the hmp transcription in enterobacteria are remained less understood. In addition, it has been reported that Hmp expression contributes differentially to bacterial virulence depending on infection phases (acute vs persistent), which suggests that RNS produced by NO-mediated reactions with molecules in animal cells can be hardly detoxified by the sole function of the flavohemoglobin. It has been open question if bacteria operate additional gene regulation system for RNS detoxification. This study presents the stationary-phase sigma factor RpoS as a potential regulator for gene transcription in bacterial response to RNS. Using Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) as a model strain, this study has aimed to understand molecular mechanisms of NsrR and RpoS by which they sense NO and regulate transcription of target genes. The first chapter provides the molecular characteristics of NsrR in regulating the hmp transcription. Val-43 residue of NsrR from S. Typhimurium was identified as a critical amino acid residue of NsrR for interacting with target hmp promoter, which determined NO consumption rate, growth rate, as well as hmp transcription, in S. Typhimurium exposed to NO. Moreover, heterogeneous amino acid+ residues in the motifs of DNA recognition helix of NsrRs from bacteria in different phyla suggested that the diversity of NsrR structure might be related with bacterial ecological niches under various pressures of NO. In the second chapter, roles of the stationary-phase sigma factor RpoS and the interaction between RpoS and its adaptor protein RssB in Salmonella RNS response were investigated. The RNS-activated increase of RpoS levels and the RpoS-dependent RNS responsive gene transcription were required for Salmonella survival in acidified nitrite-containing cultures that produce a potential consortium of RNS, thereby promoting Salmonella virulence in mice in an NO-dependent way. Increase of RpoS levels in S. Typhimurium exposed to RNS was mainly due to the RNS-mediated inactivation of the adaptor protein RssB whose function is required for transferring RpoS to ClpP and ClpX protease complex under normal growth conditions. In summary, molecular characterizations of two regulator proteins regulating transcriptions of genes necessary for the NO detoxification and RNS resistance in S. Typhimurium have provided in this dissertation by means of analyses including S. Typhimurium transcriptome, NO/RNS biochemistry, protein informatics, and mouse infection models. The findings in this study have shed light on how bacteria senses NO and transmits this signal to target genes important for bacterial fitness under NO stress.