신생물 세포형질전환 및 vemurafenib 내성을 억제하는 신규 화합물의 기전 연구

Abstract

악성 흑색종(malignant melanoma)은 멜라닌 세포의 악성화에 의해 유발되는 종양으로 주로 피부에서 발생한다. 가장 악성도가 높고 위험한 형태의 암으로 진행속도가 매우 빠르며 최근 사망률이 증가 하는 추세를 보이고 있다. 이를 치료하기 위해 악성흑색종 환자의 대부분이 가지고 있는 BRAF의 돌연변이, BRAF V600E를 표적으로 하는 가장 대표적이고 특이적인 약물인 vemurafenib가 개발되었고 널리 사용 되고 있다. 하지만 vemurafenib를 지속적으로 투여했을 경우 MAPK의 재활성이 발생하게 되어 약물에 대한 저항성이 쉽게 발생하는 것이 문제로 대두 되고 있다. 따라서 획득 된 약물에 대한 저항성은 중요한 문제가 되었으며, 이를 극복하기 위한 다양한 조절 기전에 대한 이해와 연구 그리고 새로운 치료 전략 및 효과적인 신규화합물이 필요한 실정이다. 이러한 배경으로 본 연구에서는 vemurafenib의 유도체로써 개발된 신규 화합물인 KS28이 상피세포에서 EGF에 의해 유도된 세포형질전환 억제와, vemurafenib 저항성이 발생한 흑색종 세포에서 미치는 영향 및 분자적 메커니즘을 규명하고자 하였다. 먼저 상피세포에서 KS28에 대한 연구를 진행하였는데, KS28은 JB6 Cl41에서 세포생존과 성장을 억제함은 물론 epidermal growth factor (EGF)에 의해 유도된 MAPK, c-Fos, JNK, c-Jun의 단백질 인산화를 억제 하였다. 또한 EGF에 의해 유도된 c-Fos와 c-Jun 그리고 AP-1 promoter 활성까지도 농도 의존적으로 억제 하는 것을 볼 수 있었으며 EGF에 의해 유도되는 상피세포 형질전환도 억제 하였다. 이러한 결과는 KS28가 MAPK 및 JNK 신호경로를 차단시킴으로써 신생물 세포형질전환을 억제 할 수 있음을 나타냈다. 이후 vemurafenib 저항성을 갖는 흑색종 세포에서의 효과를 확인하기 위해서, 흑색종 세포에 vemurafenib를 지속적으로 처리하여 저항성 세포를 구축하였고 이 저항성 세포에서 MAPK의 재활성, 그리고 c-Fos, JNK 및 c-Jun의 발현이 증가되는 것을 확인하였다. 이렇게 획득된 저항성을 극복하는 방법으로써 최근 연구에서는 vemurafenib와 MEK 억제제와 같은 다른 분자 표적제와의 병용요법이 저항성 세포에서 치료 효능을 증가시킬 수 있다고 보고 되었다. 본 연구에서는 KS28의 단독요법이 A375R 세포에서 vemurafenib와 MEK 억제제인 PD98059의 병용요법보다 뛰어난 세포 생존력 억제와 ERK의 인산화 발현을 억제에 더 효과적임 보였다. 따라서 새로운 화합물이 vemurafenib 저항성을 극복하기 위한 치료제로써의 잠재력을 확인 할 수 있었다. 이후 KS28의 분자적 메커니즘을 조사 한 결과 KS28은 MAPK의 재활성 및 c-Fos 단백질 인산화를 억제하였으며 c-Fos 와 AP-1 promoter 활성을 농도 의존적으로 억제 시켰다. 또한 soft agar matrix에서도 종양 생장을 매우 효과적으로 억제하는 것을 관찰 할 수 있었다. 종합적으로, 위와 같은 결과를 통하여 KS28 화합물이 다양한 세포기능을 하는 MAPK의 신호경로를 차단시킴으로써 vemurafenib 저항성을 극복 할 수 있고 신규 화합물로써의 가능성을 제안한다. |Melanoma is cancer caused by malignization of melanocytes and occurs mainly in the skin. It is the most dangerous type of cancer that progresses very fast and the mortality rate has recently increased. Most patients with metastatic melanoma harbor BRAF V600E mutation. Thus, to treat this, vemurafenib, the most representative and specific inhibitor of BRAF V600E has been developed and widely used. However, continuous administration of vemurafenib causes reactivation of MAPK, which makes it easy to develop drug resistance. Therefore, the acquired resistance to vemurafenib has become an important issue. To overcome this issue, it is necessary to understand and study various molecular mechanisms and also, we need to develop new treatment strategies and effective new compounds for overcoming vemurafenib resistance. In this study, we investigated antitumorigenic effects and molecular mechanism of KS28, a novel compound developed as a derivative of vemurafenib, on the inhibition of EGF-induced cell transformation in epithelial cells. And we also investigated inhibitory effects in vemurafenib resistant cells. First of all, we studied antitumorigenic effects of KS28 in epithelial cells. This compound inhibited the cell viability and proliferation of JB6 Cl41 cells and also phosphorylation of MAPK, c-Fos, JNK, and c-Jun induced by epidermal growth factor (EGF). Moreover, KS28 inhibited EGF-induced c-Fos, c-Jun, and AP-1 promoter activity and suppressed cell transformation of JB6 Cl41 cells in a dose-dependent manner. These results indicated that the inhibition of MAPK and JNK pathway by KS28 might be responsible for KS28`s strong inhibition of neoplastic transformation. And then, to confirm the inhibitory effects of KS28 on resistance to vemurafenib in melanoma cells, we established vemurafenib resistant cells by continuous exposure of vemurafenib to melanoma cells. We confirmed that MAPK reactivation and expression of c-Fos, JNK and c-Jun were increased in these resistant cells. As a way to overcome resistance, recent studies have reported that combined inhibition with vemurafenib and other molecular targeting agents such as MEK inhibitors may increase the therapeutic efficacy in resistant cells. In this study, treatment with KS28 alone was found to be more effective than the combination of vemurafenib and MEK inhibitor (PD98059) on inhibiting cell viability and phosphorylation of ERK in vemurafenib resistant cells. Thus, this new compound could confirm its potential as a therapeutic agent to overcome vemurafenib resistance. After investigating the molecular mechanism, we found that this compound inhibited the reactivation of MAPK, phosphorylation of c-Fos and also inhibited c-Fos and AP-1 promoter activity dose-dependently. In addition, it was observed that KS28 can suppress tumorigenicity of A375R in soft agar matrix. Taken together, these results suggest that KS28 could overcome vemurafenib resistance by blocking MAPK signaling pathways and suggest the potential as a novel compound.