Role of LRP6 in hypoxia-induced cardiomyocytes death

Abstract

LRP6 (Low-density lipoprotein Receptor-related Protein 6)는LDLR family에 속하는 막수용체로써 Wnt 신호를 활성화 시키기 위한 co-receptor로 잘 알려져 있다. Recombinant frizzled1 과 같이 Wnt 신호를 활성화 시키면 심근경색 후 심근손상이 줄어든다는 보고도 있지만, 오히려 심근세포 특이적 β-catenin 저해와 frizzled antagonist에 의해 Wnt 신호가 억제되었을 경우 심근경색 후 심근비대 와 심장기능이 개선 된다는 보고도 있다. 따라서, 심근경색에서 Wnt신호의 기능은 아직 명확하게 규명되지 않아 논란이 되고 있는 부분이다. 더욱이 Wnt의 Co-receptor로 알려진 LRP6에 대한 심근경색에서의 연구는 전혀 이루어져있지 않다. 그래서 본 연구에서는 저산소 조건에서 LRP6가 어떤 역할을 하는지 알아보고자 하였다. 먼저 심근세포는 신생백서의 심장에서 획득하였고, LRP6의 발현이 저산소 유도된 심근세포 사멸에 어떠한 영향을 미치는지 알아 보기 위해 LRP6 과발현 및 저해 아데노바이러스를 제작하였다. LRP6 과발현 및 저해 시킨 심근세포에 저산소를 유도시킨 후 MTT assay를 통해 세포생존율을 확인한 결과 저산소를 유도 했을 때 대조군 세포는 20%정도 사멸이 일어났는데 LRP6가 저해 됐을 경우 세포사멸이 40%까지 증가 되는 것을 확인하였다. 세포사멸 신호는 이른 세포사멸을 볼 수 있는 Annexin V 검출하여 확인 했을 때 shLRP6는 대조군 인 lamin과 비교하였을 때 apoptotic cell이 더 많이 검출 되는 것을 확인 하였다. LPR6 과발현은 대조군 인 Ad-lacZ와 비교하였을 때 유의한 차이는 나타나지 않았다. 늦은 세포사멸을 확인 할 수 있는 caspase-3 activity는 LRP6가 저해 되었을 때 증가 되었고 반면에 LRP6 과발현이 되었을 때 감소되었다. 또한, western blot을 통해서 절단된 caspase-3 발현을 확인했을 때도 앞선 결과와 동일한 패턴을 보였다. 그리고 세포사멸 활성 단백질인 Bax 와 세포사멸 억제 단백질인 Bcl-2 발현 량을 확인하였을 때도 LRP6의 조절이 저산소에서 세포사멸을 조절 한다는 것을 확인 할 수 있었다. 또한 세포사멸과 세포분열 조절에 중요한 역할을 하는 세포사멸 단백질 억제제로 알려진 survivin 또한 LRP6 과발현에선 증가 되었고 LRP6저해 에서 감소하는 것을 확인했다. 또한 LRP6의 어떤 부분이 저산소 유도된 심근세포사멸을 조절하는지 알아보기 위해 세 개의 돌연변이를 제작하였다. 돌연변이는 막 수용체 기준으로 N-terminal이 삭제된 ΔN, C-terminal이 삭제된 ΔC, 마지막으로 PPPSP motif의 인산화 site를 돌연변이 시킨 construct를 각각 제작하였고, 만들어진 돌연변이들이 제대로 만들어졌는지 전기영동과 염기서열 분석을 통해 확인하였고 아데노바이러스를 제작해서 이 돌연변이들이 잘 발현하는지 확인 하기 위해 농도의존적 처리하여 western blot을 통해 확인하였다. 본 연구의 결과에서 LRP6 가 저산소 유도된 심근세포의 사멸을 조절할 수 있는 표적 단백질이 될 수 있음을 확인하였다.