Low density lipoprotein receptor-related protein 5 regulates HIF-1α stability in ischemic myocardium via the interaction with PHD2

Abstract

저산소증은 심근경색과 같은 다양한 병리학적 질환과 관련이 있다. 심근경색증은 대표적인 허혈성 심장질환으로 진단과 치료의 개선에도 불구하고, 여전히 전세계적으로 높은 사망률과 장애를 유발하는 주요원인으로 알려져 있다. 저산소 유도인자인 HIF-1α는 저산소상태에서 외부위 산소 농도 변화에 적절하게 반응하기 위해 해당과정, 적혈구생성 및 생존과 관련된 유전자의 발현을 유도함으로서 세포내의 항상성을 유지시켜주는 전사인자로 중요한 역할을 한다. 따라서, 허혈성 심근경색의 치료 표적으로 HIF-1α의 활성과 발현 증진 조절을 위한 기전 연구와 활성화 가능 약물 개발 연구가 다양하게 이루어지고 있다. 본 연구에서는 LRP5라는 수용체 단백질이 저산소가 유도된 심근에서 HIF-1α의 안정성을 조절하는 새로운 타겟이 될 수 있다는 것을 확인하였다. 저밀도 지단백 관련 단백질 5 (LRP5)는 LDLR family에 속하는 수용체로로서, LRP6와 함께Wnt/β-catenin 신호경로를 활성화시키기 위한 co-receptor로서 기능을 한다. 비록 Wnt/β-catenin 신호 억제가 저산소/재관류 유도된 심근 손상을 보호하는 것으로 보고되었지만, 허혈성 심근에서 LRP5의 역할 및 관련 기전에 대한 이해가 부족하였다. 따라서, 본 연구의 목적은 저산소가 유도된 심근세포에서 LRP5의 기능을 in vitro와 in vivo에서 조사하는 것이었다. 급성 저산소증 (O2 1.2%)에 노출된 심근세포에 LRP5의 발현이 증가되는 반면, LRP6의 발현은 감소하였다. MTT와 Trypan blue staining assay을 통해 LRP5의 저해는 대조군과 비교하여 저산소로 유도된 심근세포의 생존율을 크게 증가시키고, 반대로LRP6의 저해는 심근세포의 사멸을 더욱 촉진시키는 것을 확인하였다. 이러한 결과는, LRP5와 LRP6가 저산소 유도된 심근세포의 사멸에 있어서 반대되는 역할을 기여하는 것으로 사료된다. LRP5의 저해 및LRP6가 과발현된 심근세포는 저산소 에 의해 유도된Annexin-V 양성세포, caspase-3의 활성화 및 Bax/Bcl-2 비율을 유의미하게 감소시켰다. 이와는 대조적으로, LRP5의 과발현과 LRP6가 저해된 심근세포에서는 이러한 apoptosis 신호 관련 단백질들의 발현을 증가시켰다. 이러한 결과는 LRP5와 LRP6는 저산소에 의해 발생하는 심근세포의 apoptosis를 조절함으로서 심근세포의 보호 효과를 유도한다는 사실을 보여준다. 유전자 발현 분석 (mRNA-seq) 및 qPCR 결과는 LRP5가 저산소 유도된 심근 세포에서 과발현 될 때, HIF-1α 표적 유전자의 전사 활성이 강하게 감소되는 반면, LRP5의 침묵에 의해 현저하게 상향 조절됨을 확인하였다. 또한, LRP5의 과발현은 저산소 조건 하에서 유비퀴틴-프로테아좀 경로를 통한 HIF-1α의 안정성을 악화시켰다. HIF-1α의 안정성 조절은 LRP5가 PHD2와의 결합에 의해서 HIF-1α의 산소-의존 분해 도메인 564번 프롤린 잔기를 수산화시킴으로 발생하는 것을 확인하였다. 흥미롭게도, LRP6는 PHD2와 결합하지 않는 것으로 나타났다. 본 연구는 또한, LRP5의 인산화가 HIF-1α 분해에 관여하고 Wnt/β-catenin 신호 전달 경로와 무관하다는 것을 확인 하였다. 위의 결과를 바탕으로, in vivo에서 LRP5 조절에 의한 허혈 심근 손상정도를 확인하였을 때, LRP5의 과발현은 높은 end-diastolic pressure-volume relationship (EDPVR) slope와 심장기능을 평가하는 ejection fraction (EF), blood pressure 그리고 –dp/dt max가 lacZ 대조군과 비교하여 감소되는 것을 확인하였다. 반대로, LRP5가 저해된 심근경색 모델에서는, lamin 대조군과 비교하였을 때, 심근 손상이 예방되는 것을 확인하였다. 또한, TTC stanining과 Masson’s trichrome staning을 통해, LRP5 조절 심근경색 동물모델에서 경색의 크기 및 섬유화 진행 정도를 확인하였을 때, LRP5가 저해되었을 때 보다 작은 경색 크기와 섬유화를 관찰하였다. 이러한 결과를 통해, 본 연구에서는 심근경색에서 HIF-1α의 안정성을 조절할 수 있는 새로운 조절자로서 LRP5의 역할을 규명하였고, 이는 LRP5가 허혈성 심장질환을 제어할 수 있는 신규 표적이 될 수 있는 이론적인 근제를 제시 할 수 있는 것으로 생각된다. |Hypoxia is associated with various pathologic conditions including myocardial infarction (MI). Despite improvements in the diagnosis and treatment for cardiac pathologies, MI remains the leading cause of death and disability worldwide. The transcription factor hypoxia inducible factor-1α (HIF-1α) plays a crucial role in acute hypoxic responses by activating the transcriptional target genes involved in glycolysis, erythropoiesis and survival. Therefore, activation of HIF-1α in ischemic hearts has been considered a target for therapeutic strategies. Here, this study identified that LRP5 is a novel negative regulator of HIF-1α stability in ischemic myocardium. Low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (LRP5) belongs to the LDLR family and functions as an essential co-receptor for Wnt/β-catenin signaling activation. Although inhibition of Wnt/β-catenin signaling has been reported to protect myocardial death against ischemia/reperfusion (I/R) injury, there is little understanding on the role of LRP5 in ischemic myocardium. Therefore, the aim of this study was to investigate the functions of LRP5 in hypoxia-induced cardiomyocytes in in vitro and in vivo. Exposure to acute hypoxia (O2 1.2%) in cardiomyocytes increased the expression of LRP5, whereas the expression of LRP6 decreased. The MTT and trypan blue staining assay revealed that silencing of LRP5 highly increased the survival rates of cardiomyocytes under hypoxic condition. In contrast, silencing of LRP6 more inhibited cell viability, indicating that LRP5 and LRP6 display converse function against hypoxia-induced cardiomyocytes death. Significant reductions of Annexin V-positive cells, caspase-3 activation and Bax/Bcl-2 ratio were observed in LRP5 silenced and LRP6 overexpressed-hypoxic cardiomyocytes. In contrast, LRP5 overexpression and LRP6 silencing increased Annexin V-positive cells, caspase-3 activation and Bax/Bcl-2 ratio under hypoxic conditions. Gene expression analysis (mRNA-seq) and qPCR results demonstrated that the transcriptional activity of HIF-1α target genes were strongly reduced when LRP5 was overexpressed in hypoxic cardiomyocytes, whereas they were markedly upregulated by silencing of LRP5. Overexpression of LRP5 aggravated HIF-1α stability through the ubiquitin-proteasomal pathway under hypoxc conditions. Furthermore, this study showed that LRP5 regualtes hydroxylation of HIF-1α at the oxygen-dependent degradation domain (ODDD) mediated by interacting with PHD2. Interestingly, LRP6 did not interact with PHD2. This study further identified the phosphorylation of LRP5 is responsible for HIF-1α degradation and which is independent of Wnt/β-catenin signaling pathway. Consistently, direct myocardial delivery of adenoviral constructs for either overexpression or silencing of LRP5 in in vivo showed silencing of LRP5 significantly improved cardiac function against myocardial infarction model. Together, these results demonstrated unknown role of LRP5 as a regulator of HIF-1a stability in myocardial infarction, which is provided potential value as a new target for ischemic injury treatment.