Functional Study on Microglia and Dendritic Cells in Neuroinflammation and Oxidative stress

Abstract

항원제시세포 (APC)는 외부 항원 및 병원체에 대한 정보를 인식하고 제시하는 역할을 하는 세포이다. 이러한 APC는 선천성 면역 및 적응성 면역 반응을 연결해주는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. APC는 외부 항원을 T 세포에게 전달할 수 있고 면역 반응을 개시 또는 조절할 수 있다. 또한, 각 조직 부위에 상응하는 APC는 상이한 면역학적 역할 및 기능을 갖는다. 따라서, 본 연구에서는 신경 염증 및 산화 스트레스에서 면역 조절자로서 미세아교세포 (Microglia) 및 수지상세포 (Dendritic cells, DC)의 면역 기능을 연구 하였다. 괭생이 모자반은 쥐에서 유래된 대식세포에 대하여 항 염증 활성을 나타내는 갈조류로 알려져 있으나, 미세아교세포에 대한 괭생이 모자반 추출물 (S. horneri extract)의 항 신경염증 효과 및 메커니즘은 아직 연구되지 않았다. 따라서 나는 BV-2 미세아교세포에 대한 S. horneri extract의 항 신경 염증 효과를 연구하였다. S. horneri extract의 세포 독성 및 일산화질소 (NO)의 생성은 각각 Annexin V/PI staining 및 Griess assay를 통해 측정하였다. 전 염증성 인자들의 mRNA 발현 수준을 역전사-중합 효소 연쇄반응 (RT-PCR)에 의해 결정하고, 사이토카인 생성을 ELISA 기법에 의해 평가하였다. MAPKs와 NF-κB의 단백질들의 발현 수준은 western blot 분석에 의해 확인하였다. S. horneri extract는 BV-2 미세아교세포에 대한 세포 독성이 없었으며, 지질 다당체 (LPS)에 의한 NO의 생성을 현저하게 감소시켰다. 또한, S. horneri extract의 처리는 LPS로 자극된 미세아교세포에서 IL-1β, IL-6, iNOS, COX-2 및 TNF-α 등의 전 염증성 인자들의 mRNA 수준을 농도 의존적으로 감소시켰다. 또한 S. horneri extract는 iNOS와 COX-2의 단백질 발현 수준을 감소시켰고, TNF-α 및 IL-6를 포함한 사이토카인의 발현 또한 감소시켰다. S. horneri extract는 ERK, p38 및 p65의 인산화를 억제함으로써 항 신경 염증 효과를 이끌어 냈다. 이러한 결과는 S. horneri extract가 MAPKs 인산화 및 NF-κB의 신호전달을 억제함으로써 LPS로 자극된 미세아교세포의 활성화에 대해 항 신경 염증 효과를 가진다는 것을 시사한다. Part II에서는 DC의 기능이 산화/환원 상태 조절에 의해 조절 될 수 있는지 여부를 조사하였다. 산화스트레스는 세포 기능 장애, DNA 손상 및 노화 관련 인자의 발현에 의해 노화 관련 장애를 유발 한다. 또한, 면역 노화는 면역기능을 감소시키고, 적응성 면역 반응의 불균형을 초래한다. 따라서 본 연구에서는 산화 스트레스에 의한 DC의 면역 기능 변화을 연구하였다. 그 결과, 저농도의 산화 스트레스 DC에서 공동 자극 분자의 발현이 증가되었으나, 고농도의 산화 스트레스 DC에서 공동 자극 분자의 발현이 감소하였고 세포 독성도 관찰되었다. 또한, 산화스트레스는 DC에서 ROS의 생성을 유도하였으나, 항원포식능을 감소시켰다. DC의 IL-12의 생성은 DC의 활성화의 중요한 지표이며 T 세포 반응 개시 뿐만 아니라 Th1/Th2의 극성화에 관여한다. 산화스트레스 상태에서 DC에 의해 생성된 IL-12의 양을 측정한 결과, LPS 자극에 의해 IL-12의 생성이 감소 된 것으로 관찰되었다. 산화스트레스가 DC에서 미토콘드리아 막 전위 (MMP, Ψm)를 손상시켜 Bax 발현 및 cleaved caspase-3/-9의 발현을 증가시키기 때문에 이러한 결과는 산화스트레에 의한 DC의 세포 독성이 미토콘드리아의 세포사멸 신호전달 경로에 의해 나타난다는 것을 알 수 있다. 따라서, 항산화 물질에 의한 산화스트레스 조절이 DC의 기능을 회복시키는지 여부를 확인하고자 NAC (N-Acetyl-L-Cysteine)를 처리하여 실험을 진행하였다. NAC 처리는 산화스트레스에 의한 세포 독성, ROS 생성 및 손상된 MMP (Ψm)를 회복시켰을 뿐만 아니라, NAC 처리는 산화스트레스에서 DC의 공동 보조 자극 분자들의 발현을 회복시켰다. 결론적으로, 미세아교세포의 조절은 신경 염증의 조절에 중요한 역할을 하며, 산화스트레스에 의해 야기된 DC의 기능의 손상은 항 산화 인자에 의해 회복되는 것으로 관찰되었다. |Antigen presenting cells (APCs) are responsible for recognizing and presenting information on external antigens and pathogens. These cells are known to play a role in linking innate and adaptive immune responses. APCs can transmit external antigens to T cells and can initiate or regulate immune responses. In addition, APCs corresponding to each tissue site has a different immunological role and function. Therefore, in present study, I studied the immunological function of microglia and dendritic cells (DCs) as immune regulators in neuroinflammation and oxidative stress. In the part I, Sargassum horneri (Turner) C. Agardh is a brown algae species that exerts anti-inflammatory activity toward murine macrophages. However, the anti-neuroinflammatory effects and the mechanism of S. horneri (Turner) C. Agardh extract on microglia cells are still unknown. I investigated the anti-neuroinflammatory effects of S. horneri extract on BV-2 microglia. S. horneri extract cytotoxicity and nitric oxide (NO) production were measured by Annexin V/PI staining and the Griess assay, respectively. mRNA expression level of pro-inflammatory factors were determined by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR), and cytokine production was evaluated by enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs). Protein expression level of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) and nuclear factor-B (NF-B) were detected by western blot analysis. S. horneri extract was not cytotoxic to BV-2, and it significantly decreased lipopolysaccharide (LPS)-induced NO production. Moreover, S. horneri extract treatment reduced mRNA level of pro-inflammatory cytokines including inducible NO synthase, cyclooxygenase-2, interleukins (ILs)-1β and -6, and tumor necrosis factor-α in LPS-stimulated microglia cells in a dose-dependent manner. S. horneri extract also diminished the protein expression of iNOS, COX-2, and cytokines including TNF-α and IL-6. S. horneri extract elicited anti-neuroinflammatory effects by inhibiting phosphorylation of extracellular signal-regulated kinase (ERK), p38, and NF-B-p65. These results suggested that S. horneri extract exerted anti-neuroinflammatory effects on LPS-stimulated microglia cell activation by inhibiting MAPKs phosphorylation and NF-B signaling. In part II, I examined whether the function of DCs could be regulated by redox status regulation. Oxidative stress induced age-related disorders by cellular dysfunctions, DNA damage and expression of senescence-related factors. In addition, immune senescence also shows decreased immunological functions and imbalance of adaptive immune responses. Therefore, I studied the immunological function of DCs in response to oxidative stress. As shown in the results, the expression of co-stimulatory molecules in DCs was increased by low concentration of oxidative stress. However, high concentration of oxidative stress was applied to DCs, the expression of co-stimulatory molecules decreased and cytotoxicity was also observed. In addition, oxidative stress induced the production of ROS in DCs, but decreased antigen uptake capacity. IL-12 production of DCs is an important marker of DCs activation and involved in the T cell priming as well as the polarization of Th1/Th2. As a result of measuring the amount of IL-12 produced by DCs in the oxidative stress state, it was observed that IL-12 production was reduced by LPS stimulation. These results are attributed to cytotoxicity, as oxidative stress impairs mitochondrial membrane potential (MMP, Ψm) in DCs, increasing Bax expression and cleaved caspase-3/-9 expression. For reason of this, I determined whether oxidative stress regulation restored the function of DCs. As a result, NAC (N-Acetyl-L-Cysteine) treatment restored the oxidative stress-induced cytotoxicity, ROS production, and MMP. Also, NAC treatment rehabilitated the co-stimulatory molecules expression of DCs in oxidative stress. In conclusion, the regulation of microglia is important for the regulation of neuroinflammation, and the damage of DCs function caused by oxidative stress was observed to be restored by antioxidant factors.