Antimicrobial activity and mechanism of antimicrobial peptide Hylin a1 and its analog peptides against multidrug resistant bacteria

Abstract

항생제 오남용 문제로 인한 항생제 내성은 점점 가속화되고 있다. 스스로를 방어하기 위해 만들어낸 자체 방어 능력을 지닌 다제 내성 균주가 증가함으로써 심각한 결과가 초래되고 있다. 항생제의 개발에도 불구하고, 이용 가능한 약제의 수가 제한되어 치료가 불가능한 상황이다. 이로 인해, 항생제를 대체할 수 있는 후보 물질로 항균 펩타이드(antimicrobial peptide, AMP)가 주목받고 있으며, 그에 대한 개발은 점차 증가하고 있다. AMP는 대부분 유기체에서 발견되며, 구조적으로 10-50개의 아미노산으로 이루어져 있고 주로 양전하를 띠며 30% 이상의 소수성 아미노산 잔기를 포함하고 있다. 이러한 특징으로 인해 음전하를 가지는 박테리아의 막과 접촉하게 되면 세포막을 파괴시키거나 구멍을 내고 세포막의 전위를 소실시켜 박테리아의 사멸을 유도하기도 한다. 이러한 항생 펩타이드는 다양한 항균 작용 기작을 가지고 있으며 구조적, 기능적 다양성을 나타낸다. 이전의 연구에서, 전기 자극을 받은 남미 개구리의 점액질에서 분리된 Hylin a1은 그람 음성 및 그람 양성 균주에 대해 항 항균 활성을 보이지만 적혈구 세포에 강한 용혈 현상을 보이는 18개의 아미노산으로 확인되었다. 본 연구에서는, Hylin a1의 잔기를 바탕으로 페닐 알라닌을 알라닌으로 치환한 Hylin a1-2A와 글라이신을 라이신으로 치환한 Hylin a1-3K, Hylin a1-11K 와 Hylin a1-15K, 총 4개의 유사체 펩타이드를 디자인하였다. 이러한 유사체 펩타이드는 Hylin a1보다 그람 음성, 그람 양성 및 내성 균주에 뛰어난 항균 효과를 보였으며, 바이오필름 억제와 제거 효과가 매우 우수함을 확인하였다. Hemolysis assay를 통해 Hylin a1에서 보였던 용혈 현상이 유사체 펩타이드에서는 현저히 줄어드는 결과를 관찰하였다. 그람 음성 및 그람 양성 박테리아의 대표 균주를 선정하여 유사체 펩타이드에 의한 박테리아 사멸 속도를 확인하였으며, Hylin a1-11K 및 Hylin a1-15K가 10분 이내에서 가장 빠르고 효과적으로 작용한다는 것을 확인하였다. 또한 생체 내의 안정성을 확인하기 위해 여러가지 염 농도와 사람의 혈청에서 항생 펩타이드의 항 미생물 효과를 확인하였으며, 그 결과 Hylin a1-11K 및 Hylin a1-15K가 생체 내의 조건에서도 안정성을 가지며, 효과적으로 박테리아를 억제할 수 있다는 결과를 확인하였다. 또한, 원편광 이색성 분광법 (Circular dichroism, CD) 을 이용하여 박테리아 막의 유사 환경에서 유사체 펩타이드의 이차 구조 분석을 분석한 결과, 결합 친화성을 가지는 알파 헬릭스 구조를 가지는 것으로 확인하였다. 이러한 생물학적 활성 분석을 바탕으로 유사체 펩타이드의 작용기전을 살펴보기 위해, 독소 인자인 LPS와 LTA에 대한 결합 친화성을 CD spectroscopy를 측정하였다. 그 결과, Hylin a1-11K와 Hylin a1-15K는 모두 결합 친화성을 가졌으며, Hylin a1-2A와 Hylin a1-3K는 선택적으로 LTA에서만 친화성을 가졌다. 또한 인공적인 리포좀을 형성하여 형광물질인 calcein의 방출을 측정함으로써 포유류와 유사한 구성의 lipid와 박테리아 유사 lipid에서 선택성을 가진다는 것을 확인하였다. n-phenyl-1-naphthylamine (NPN)를 이용한 외막 투과성 분석과ortho-nitrophenyl-β-galactoside (ONPG) 을 이용한 내막 투과성 분석, 3,3’-dipropylthiadicarbocyanine iodide (diSC3-5) 을 이용한 전위차에 따른 막 투과성 분석, SYTOX green과 Propidium iodide (PI) 을 이용한 원형질막 투과성 분석 실험을 통해 유사체 펩타이드는 완전히 박테리아 막을 표적으로 작용하는 메커니즘을 규명하였다. 유사체 펩타이드 Hylin a1-11K와 Hylin a1-15K는 마우스의 마크로파지 세포에서 TNF-α, IL-6, IL-1β와 같은 염증인자의 발현이 현저히 줄어든다는 결과를 확인하였으며, 결과적으로 유사체 펩타이드는 뛰어난 항 미생물 활성을 가졌으며, 독성 또한 현저히 줄어들었다. 항 바이오필름 효과와 박테리아 막을 완전히 분열시킨다는 메커니즘을 입증하였으며, 항 염증반응 효과를 확인하였다. 결과적으로, Hylin a1을 바탕으로 몇 개의 잔기를 치환한 유사체 펩타이드는 항 미생물 효과와 항 바이오필름 활성 및 항 염증 효과가 있음을 증명하였으며, 항생제를 대체할 만한antimicrobial peptide로써 활용가치가 있다고 전망된다.|The increase in the prevalence of multidrug-resistant bacterial strains due to the misuse of antibiotics has serious consequences on human health. Despite the development of antibiotics, in some situations, treatment is limited by the small number of antibiotics currently available. Antimicrobial peptides have attracted attention as new drug candidates and their development is progressing. In a previous study, Hylin a1, isolated from the skin of electrically stimulated Latin American frogs, showed antimicrobial activity against Gram-negative and Gram-positive bacteria; Hylin a1 was identified as an 18-amino acid antimicrobial peptide with strong hemolytic activity against red blood cells. In this study, Hylin a1-2A, Hylin a1-3K, Hylin a1-11K, and Hylin a1-15K were formed by substituting lysine (K) and alanine (A) based on the residues of Hylin a1. The analog peptides showed better antimicrobial effects against Gram-negative bacteria, Gram-positive bacteria, and resistant strains than Hylin a1 and effectively inhibited and reduced biofilm formation. Hemolysis analysis showed that analog peptides are less toxic to red blood cells than Hylin a1. Hylin a1-11K and Hylin a1-15K appeared quickly and efficiently within 10 min according to measurements of the rate of action of the peptide toward bacteria. In addition, at various salt concentrations and in the presence of human serum, Hylin a1-11K and Hylin a1-15K effectively inhibited bacteria. Secondary structure analysis of analog peptides in membrane-like environments by circular dichroism spectroscopy revealed α-helix structures. Based on the biological activity assay, circular dichroism spectroscopy was performed to measure the binding affinity for Gram-negative and Gram-positive bacteria, lipopolysaccharide, and lipoteichoic acid. Consequently, Hylin a1-11K and Hylin a1-15K showed binding affinity, whereas Hylin a1-2A and Hylin a1-3K exhibited selective affinity only in lipoteichoic acid. In addition, liposome formation and measurement of the release of fluorescent calcein confirmed the selectivity in lipids such as bacterial and mammalian cell membranes. N-phenyl-a-naphthylamine, ortho-nitrophenyl-β-galactoside, 3,3’-dipropylthiadicarbocyanine iodide, and SYTOX green uptake and propidium iodide revealed that the analog peptides completely disrupted the bacterial membrane. Hylin a1-11K and Hylin a1-15K significantly reduced the expression of pro-inflammatory cytokines in mouse macrophage cells. Hylin a1-11K and Hylin a1-15K exhibited significant therapeutic effects upon infection with the multidrug-resistant strain of Acinetobacter baumannii. Overall, analog peptides in which several residues were substituted based on Hylin a1, showed antimicrobial and anti-inflammatory effects and may serve as the next-generation antimicrobial peptides that can replace antibiotics.