Isolation and characterization of a fibrin(ogen)olytic protease from Lepidasthenia izukai

Abstract

ABSTRACT

Isolation and Characterization of a Fibrin(ogen)olytic from Lepidasthenia izukai

Sang-Gu Yun Advisor: Prof. Jung Sup Lee, Ph.D. Department of Life Science Graduate School of Chosun University

This study was performed to purify and characterize biochemically a serine protease from a marine polychaete Lepidasthenia izukai. To purify the enzyme, a five-step procedure consisting of ammonium sulfate fractionation (20~80% in saturation concentration), Hiprep 16/10 Q FF, two-sequential Mono Q 4.6/100 PE column anion exchange, and finally Superdex 75 10/300 GL size exclusion chromatographies were employed in order. The resulting purified enzyme was named LIZ (stands for Lepidasthenia izukai). The purified LIZ enzyme had a specific activity of 1,628 units/mg and the yield was 0.9% from approximately 50 g of the L. izukai worm cell lysate. The estimated molecular weight of the purified enzyme was found to be approximately 28 kDa, as determined by 12% sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel electrophoresis. The optimal pH for the activity of LIZ was approximately 7.5 and the enzyme activity was relatively stable under the temperature range of 20~60℃. In addition, the proteolytic activity of LIZ was clearly inhibited by serine protease inhibitors such as phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) and diisopropyl fluorophosphate (DFP), but not by metalloprotease inhibitors, including 1,10-phenanthroline (1,10-PT) and ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), suggesting that the enzyme is a typical serine protease. Among the chromogenic substrates tested, S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-pNA), a typical substrate for tissue plasminogen activator (t-PA), was the most suitable one for the purified enzyme, implying that the enzyme can cleave the carboxyl side of Arg in the synthetic peptide substrate. The purified enzyme also efficiently cleaved various blood coagulation-related proteins, including fibrinogen, prothrombin, and plasminogen. The purified LIZ enzyme showed a typical fibrin(ogen)olytic activity in vitro, as it could digest all the Aa, Bb, and g chains of fibrinogen within 20 min and cleave cross-linked fibrin polymer and fibrin as well. In addition, the enzyme could exhibit a proteolytic activity in cleaving the fibrin clots formed in human blood plasma and also on the fibrin plate. The fibrin plate assay also showed that 1 μg each of LIZ and plasmin formed 1.8 cm, and 1.2 cm of halo zones in diameters, respectively, on the fibrin plate, indicating that the adjusted plasmin unit of LIZ is equivalent to 0.004 plasmin units in digesting the fibrin clots. All these results suggest that the purified LIZ enzyme is active fibrin(ogen)olytic serine protease that can dissolve blood thrombi. |IV. 초록

이즈카긴비늘갯지렁이로부터 피브린분해 단백질분해효소의 분리 및 생화학적 특성분석

윤 상 구 지도교수 : 이 정 섭 생명과학과 조선대학교 대학원

본 연구는 국내 서·남해안에 서식하는 다모강 환형동물문의 하나인 이즈카긴비늘갯지렁이(Lepidasthenia izukai)로부터 피브리노겐 및 피브린을 분해하는 단백질분해효소를 순수 분리하여 그 생화학적 특성을 규명하기 위하여 수행되었다. 이즈카긴비늘갯지렁이를 균질기로 갈아 원심분리하여 상층액을 모은 뒤, 20~80% ammonium sulfate로 분획하여 농축하였고, HiPrep 16/10 Q FF와 Mono Q 4.6/100 PE 등을 이용한 두 종류의 음이온 크로마토그래피와 Superdex 75 10/300 GL 크기-배제 크로마토그래피를 사용하여 해당 단백질분해효소를 정제하였다. 순수분리한 단백질분해효소를 LIZ(Lepidasthenia izukai)라 명명하고, 효소활성 등을 포함한 생화학적 특성을 규명하였다. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 확인한 결과, LIZ 효소의 분자량은 약 28 kDa이었으며, PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)가 없는 경우, 자가분해가 일어남을 알 수 있었다. LIZ 효소의 최적 pH는 약 7.5이었으며, 효소 활성은 20~60℃에서 일정하게 유지되었다. 또한 LIZ의 활성은 PMSF 및 diisopropyl fluorophosphate(DFP)와 같은 전형적인 세린계열 단백질분해효소 저해제들에 의해서 억제되었지만, ethylenediaminetetraacetic acid(EDTA) 및 1,10-phenanthroline(1,10-PT)과 같은 금속성단백질분해효소 저해제들에 의해서는 억제되지 않았다. 이러한 결과는 LIZ는 전형적인 세린계열 단백질분해효소임을 시사한다. LIZ 효소는 프로트롬빈, 피브리노겐, 플라스미노겐과 같은 다양한 혈장 단백질들을 10분 내에 빠르게 절단할 수 있었다. 발색성 펩타이드 기질을 이용한 기질 절단자리 분석을 통하여 LIZ는 전형적인 t-PA 기질인 S-2288(H-D-Ⅱe-Pro-Arg-pNA)을 가장 잘 절단함을 확인하였다. LIZ 효소는 피브리노겐의 Aα 사슬을 30초 내에, Bβ 사슬을 10분 내에, γ 사슬은 20분 내에 모두 절단하였고, 교차연결 피브린의 α-α와 γ-γ 사슬도 0.5 μg의 적은 양으로도 잘 분해한다는 사실도 확인하였다. 또한 이 효소는 혈장 내의 피브린 섬유도 분해할 수 있는 효소활성을 지니고 있었다. 피브린 평판법을 통해 3 μg의 LIZ는 0.01 U의 플라스민과 동일한 피브린 분해능을 가지고 있음도 확인하였다. 이상의 결과는 LIZ는 피브린의 Aα 또는 Bβ사슬만을 가수분해할 수 있는 여타의 혈전분해효소들과는 달리, 혈전을 매우 효과적으로 분해할 수 있는 가능성을 지닌 효소임을 시사하는 것이다.