Enantiodiscrimination Studies on Chiral Amines and Acids Using Polysaccharide-derived Chiral Stationary Phases

Abstract

Chiral separation has become a major concern in the pharmaceutical industry. In highly enantioselective biological environment of our living system, the two enantiomers of a chiral pharmaceutical will react differently with their complementary receptor or enzyme and produce diverse biological activities. In fact, one enantiomer may be biologically active and produce desired activity, while the other may create various side effects and problems in our body. In this context, there is an increasing demand for the analysis of chiral compounds and the preparation of optically active and pure stereomers or enantiomers for biologically important pharmaceuticals or drugs. Accordingly, for the enantiomerically pure pharmaceuticals, the constant development of efficient and validated analytical methods for enantiomeric separation and analysis of racemic chiral pharmaceuticals is required. Chiral high performance liquid chromatography (HPLC) using various chiral stationary phases (CSPs) is one of the most effective and widely used method for the resolution and analysis of the enantiomers of a chiral drug. Chiral amines and acids are of particular interest in pharmaceuticals as they were found as key intermediates in drugs and drug candidates. This dissertation is designated to develop simple, convenient, validated and readily available normal phase chiral HPLC methods for the enantiomer separation of chiral amines and acids as well as the determination of enantiomeric purity and their absolute configuration using polysaccharide-derived CSPs. Since the chiral amines and acids used in the study show low ultraviolet (UV) absorption, achiral derivatization using several potent derivatizing agents was performed to provide good interaction sites for enantiodiscrimination as higher detection sensitivity for analytes. Computer-aided molecular modeling study was performed to ascertain the mechanism of chiral recognition and the elution order between the investigated analytes and the employed CSP. The differences in the binding energies corresponded to the separation and the elution order of investigated analytes in the HPLC experiments.

In Chapter 2, several chiral aliphatic amines including amino alcohols were derivatized using a fluorogenic achiral derivatizing agent, 4-chloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole (NBD-Cl) for enantiomeric resolution by normal phase HPLC on six covalently bonded and four coated type polysaccharide-derived CSPs under simultaneous UV and fluorescence detection (FLD). Out of six covalently bonded CSPs, Chiralpak IE showed the best enantiomer separation and resolution for most of the analytes. Amylose-derived coated type CSPs, Chiralpak AD-H and Lux Amylose-1 generally exhibited better enantiomer separation of NBD derivatized chiral amines than cellulose-derived Chiralcel OD-H and Lux Cellulose-1 CSPs. The impurity of commercially available (R)- and (S)-leucinol was found to be 0.06% for both analytes. After the validation experiments, this developed method proved to be precise and enantioselective for the separation of chiral aliphatic amines including amino alcohols as NBD derivatives under simultaneous UV and FL detection.

In Chapter 3, a chromatographic method for enantiomer separation of chiral amines as 2-hydroxynaphthaldimine derivatives on several polysaccharide-derived CSPs was developed. 2-Hydroxynapthaldehyde was introduced as a potent derivatizing agent for the first time in this study to enhance detection sensitivity and also to provide suitable interaction sites for chiral separation. Amongst the examined CSPs, in general, the cellulose-derived CSPs showed better enantiomer separation than the amylose-derived CSPs. In particular, the covalently bonded type Chiralpak IC with cellulose-based chiral selector showed the best enantioseparation and resolution. The developed analytical method using 2-hydroxynaphthaldehyde as derivatizing agent was employed to determine the enantiomeric purity of commercially available (R)- and (S)-leucinol and the impurities of the investigated analytes from two distributors were found to be 0.06-1.20%. This analytical method was validated in accordance with ICH guidelines and it proved to be sensitive, precise and applicable for the enantiomer separation of chiral aliphatic amines as 2-hydroxynaphthaldimine derivatives under UV detection on normal phase HPLC.

In Chapter 4, the liquid chromatographic enantiomer separation of various chiral acids as 1-naphthylamides was performed using ten CSPs derived from amylose and cellulose tris phenylcarbamates. Most of the analytes under consideration were base-line separated with good separation and resolution factors. In general, the enantioselectivities observed on coated type columns were better than those on covalently bonded type columns. Especially, the performance of coated type Lux Cellulose-1 column was superior for the enantiomer separation and resolution of chiral acids as 1-naphthylamide derivatives to those of the other CSPs, except for 2-aryloxypropionic acid derivatives. Owing to the strong UV absorbance of the 1-naphthyl group and method validation results, the analytical method developed in this study could be valuable and sensitive for the enantiomer separation of various chiral acids as 1-naphthylamide derivatives using polysaccharide-derived CSPs.

In Chapter 5, normal phase liquid chromatographic enantiomer separation of chiral amines was performed on amylose and cellulose-derived CSPs using three aromatic aldehyde derivatizing agents. Enantiomeric separation ability of three aromatic aldehyde derivatizing agents on normal HPLC was studied and compared between amylose and cellulose-based CSPs under UV detection. The impact of the structural makeup of both derivatizing agents and CSP types on enantiodiscrimination of chiral amines was also elucidated. The enantioselectivities and resolutions obtained on amylose-derived CSPs were greater than on cellulose-derived CSPs, except for 2-hydroxynaphthaldimine derivatives on cellulose-derived CSPs. The most conformationally flexible 2-naphthaldimine derivatives using three kinds of derivatizing agents afforded the greatest enantioseparation on conformationally flexible amylose-derived CSPs and vice-versa. Molecular modeling studies were performed and compared using AutoDock and PyMOL software to elucidate the chiral recognition mechanism involving 2-naphthaldimine and 2-hydroxynaphthaldimine derivatives on amylose derived CSP having the chiral selector of amylose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate). It was observed that hydrogen bonds, π-π and hydrophobic interactions were the major forces involved during chiral separation. The theoretical data obtained were in good accordance with the chromatographic results from the developed chiral HPLC method.

In Chapter 6, fluorene-2-carboxaldehyde was used as an achiral derivatizing agent for the first time to separate the enantiomers of chiral aliphatic amines including amino alcohols by normal phase HPLC under UV detection. Among six covalently bonded and four coated type polysaccharide-derived CSPs of amylose or cellulose-based chiral selectors, all the analytes were either partially or base-line separated on Chiralpak IE and Chiralpak IF columns. In particular, cellulose-derived CSPs showed the best enantiomer separation especially for amino alcohol analytes as fluorene-2-carboxaldimine derivatives. 2-amino-4-methyl-1-pentanol analyte (leucinol) showed the best enantiomer separation and resolution on both coated type and covalently bonded CSPs of the same chiral selector as cellulose tris(3,5-dimethylphenylcarbamate). Among the chiral aliphatic amines, enantiomer separation of α-methylbenzylamine containing aromatic group was effective and showed the better enantiomer separation and resolution. Intra- and interday accuracy and precision experiments were done to evaluate the presently developed analytical method and proved to be quite precise and selective for the separation of chiral amines including amino alcohols as fluorene-2-carboxaldimine derivatives.

Index Terms: Chiral amine, Chiral acid, Chiral high performance liquid chromatography, Enantiomer separation, Polysaccharide-derived chiral stationary phase, Molecular docking

|키랄성 물질의 광학분리는 제약산업의 주요 관심 분야이다. 우리 생체 시스템은 고도의 광학이성질체로 이루어져 있기에, 키랄 의약품의 두 거울상 이성질체는 이들 수용체나 효소에 따라 입체화학적으로 다르게 반응하기 때문에 서로 다른 생리학적 특징을 나타낼 수 있다. 따라서, 하나의 거울상 이성질체는 생물학적 활성 및 질병 치료효과가 있는 반면, 또 다른 형태의 거울상 이성질체는 질병 치료효과는 없으면서 부작용을 야기시킬 수 있다. 그리하여, 키랄 제약산업에서 광학활성물질 분리분석법과 함께, 광학적으로 순수한 광학이성질체를 제조하기 위한 요구가 증가하고 있다. 따라서, 하나의 형태의 순수한 광학이성질체 화합물을 분리분석 또는 제조하기 위해서는 효율적이고 검증된 키랄분석방법의 지속적인 개발이 요구된다. 다양한 키랄 고정상을 사용하는 키랄 고성능 액체 크로마토그래피는 키랄 약물의 거울상 이성질체의 분석에 가장 효과적이고 널리 사용되는 방법 중 하나이다. 키랄 아민과 키랄 카르복실 산은 키랄 의약품 및 키랄 약물 후보물질의 핵심 중간체로 알려져 있기에 키랄 의약품 합성과정에서 매우 중요하다. 본 논문들의 주요 내용은 키랄 아민 및 카르복실 산의 거울상 이성질체 분리뿐 만 아니라 이들의 광학순도 측정 및 다당류 유래 키랄 고정상을 사용하는, 편리하고, 효과적인 순상 키랄 액체 크로마토그래피 분석법 개발에 대한 연구내용이다. 본 연구에 사용된 키랄 아민과 키랄 카르복실 산은 낮은 자외선 흡수를 나타내기 때문에, 여러 잠재적인 방향족 유도체 시약으로 유도체화를 수행하였는데 이들의 방향족 구조를 통해 높은 검출 감도가 가능하면서도 효과적인 광학분리를 위한 상호작용 부위를 제공하고자 하였다. 보다 심층적인 연구를 위해, 유도체화된 분석물질과 키랄 고정상 사이의 키랄 인식 메커니즘으로 안정화된 에너지와 용출 순서를 확인하기 위해 컴퓨터-보조 분자 모델링 연구를 수행하였다. 이론적인 컴퓨터 모델링 연구를 통해 얻은 결합 에너지의 차이는 액체 크로마토그래피 실험에서 광학분리된 분리결과 및 용출 순서와 일치하였다.

제 2장에서는, 아미노알코올을 포함한 키랄 지방족 아민 화합물을 순상 액체 크로마토그래피에 의한 거울상 이성질체의 광학분리 하기위해 형광성질을 띠는 유도체 시약인 4-chloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazole 을 사용하여 유도체화하였다. 자외선 및 형광 검출 을 동시에 수행하면서 여러 다당류에서 유도된 키랄 고정상을 사용하였다. 키랄 선택자가 공유결합 된 6 개의 키랄 고정상가운데, Chiralpak IE는 대부분의 분석물에 대해 가장 좋은 광학분리 및 분리인자를 나타냈다. 일반적으로 아밀로오스 유도체의 키랄 선택자가 코팅 된 Chiralpak AD-H 및 Lux Amylose-1 키랄 고정상은 셀룰로오스 유도체의 키랄 선택자가 코팅 된 Chiralcel OD-H 및 Lux Cellulose-1 키랄 고정상보다 NBD 유도체화 키랄 아민 화합물이 우수한 광학분리를 나타내었다. 시판중인 (R) 및 (S)-류신올 화합물 내의 광학불순물은 두 분석 물질에서 모두 0.06% 였다. 검증 실험을 통해, 이 개발된 분석법은 자외선 및 형광의 동시 검출 하에서 NBD 유도체로서 아미노 알코올을 포함하는 키랄 지방족 아민의 분리에 대해 신뢰할 수 있는 키랄분석법임을 입증하였다.

제 3장에서는 여러 다당류 유래 키랄 고정상에서 2-hydroxynaphthaldimine유도체로서의 키랄성 아민을 광학분리하는 키랄 크로마토그래피 방법을 서술하였다. 이 연구에서는 2-hydroxynapthaldehyde를 처음으로 유도체화 시약으로 도입하여 검출 민감도를 높이고 키랄 광학분리를 위한 적절하게 반응하는 부위를 제공하였다. 실험에서 사용된 키랄 고정상 중에서, 셀룰로오스 유도된 키랄 고정상은 아밀로오스 유도된 키랄 고정상 보다 우수한 거울상 이성질체 분리를 보였다. 특히, 셀룰로오스계 키랄 선택자가 공유결합된 Chiralpak IC는 최상의 광학 분리 및 분해인자를 나타내었다. 유도체화 시약으로 2-hydroxynaphthaldehyde를 사용하여 개발된 분석방법을 사용하여 (R)- 및 (S)-류신올의 거울상 이성질체 광학순도를 측정하였는데, 조사된 이들 분석물의 광학불순물은 0.06-1.20% 였다. 이 분석방법은 ICH 지침에 따라 검증실험되어, 순상 액체 크로마토그래피 에서 자외선 검출하에 2-hydroxynaphthaldimine 유도체로서 키랄 지방족 아민의 거울상 이성질체 광학분리 분석법은 본 연구에 적합하며 효과적으로 적용가능하다는 것이 입증되었다.

제 4 장에서는, 다양한 키랄 카르복실 산을 미량 검출이 용이하도록 1-naphthylamides 유도체화한 후 이들을 대상으로 한 광학분리를 아밀로오스 및 셀룰로오스 유도체에 기초한 10 개의 액체 크로마토그래피 키랄 고정상 를 사용하여 수행하였다. 대부분의 분석물의 광학분리 실험에서 기준분리와 분리계수 결과가 양호했다. 일반적으로, 코팅형태 컬럼에서 관찰된 거울상 이성질체 광학선택성은 공유결합형태 컬럼에서 관찰된 결과보다 더 좋은 것으로 나타났다. 특히, 2-aryloxypropionic acid 분석물질의 유도체를 제외하고는, 1-naphthylamide 유도체로서의 키랄 카르복실 산의 광학분리에서 다른 키랄 고정상 에 비해 코팅형 Lux Cellulose-1 컬럼의 성능이 우수하였다. 1-나프틸 그룹의 높은 자외선 흡광도 성질과 검증된 분석법 결과를 바탕으로, 다당류 유래 키랄 고정상 를 사용하여 본 연구에서 개발된 1-naphthylamide 유도체로서 다양한 키랄 카르복실 산의 거울상 이성질체 광학분리는 매우 유용하고 실제적인 것으로 보아진다.

제 5 장에서는, 3 개의 방향족 알데히드 유도체 화제를 사용하여 아밀로오스와 셀룰로오스 유래 키랄 고정상 에 대해 키랄 아민의 순상 액체 크로마토그래피 거울상 이성질체 분리를 수행 하였다. 3 가지 나프틸 알데히드 유도체 시약의 일반적인 액체 크로마토그래피 에 대한 광학분리분석을 수행하였고 UV 자외선 검출 하에서 아밀로오스와 셀룰로오스 기반 키랄 고정상 에서의 실험결과를 비교하였다. 키랄 아민의 거울상 이성질체 아민에 대한 유도체 시약 종류 및 키랄 고정상 유형의 구조적 형태에 따른 결과를 비교하였다. 본 연구에서 셀룰로오스를 기초로 한 키랄 고정상의 2-hydroxynaphthaldimine 유도체의 광학분리를 제외하고는, 아밀로오스에서 유도된 키랄 고정상 에서 얻은 거울상 이성질체 광학분리는 셀룰로오스 유래 키랄 고정상 결과보다 더 컸다. 3 종류의 나프틸 유도체화 시약을 사용하여 가장 구조적으로 유연한 2-naphthaldimine 유도체는 구조적으로 유연한 아밀로오스에 기초한 키랄 고정상 에서 가장 큰 광학분리를 나타내었으며 그 반대도 마찬가지였다. 본 실험의 키랄 물질과 키랄 고정상을 대상으로 분자 모델링 연구를 수행하고자 AutoDock 및 PyMOL 소프트웨어를 사용하였다. 분자 모델링 결과에서, 아밀로오스 tris(3,5-dimethylphenylcarbamate)의 키랄 선택기를 갖는 아밀로오스 유도된 키랄 고정상 에서 2-naphthaldimine 및 2-hydroxynaphthaldimine 유도체를 포함하는 키랄 인지 메커니즘을 밝혀냈다. 수소 결합, π-π 및 소수성 상호 작용이 키랄 광학분리와 관련된 주요 힘이었다는 것이 관찰되었다. 얻어진 이론적인 데이터는 실험으로 수행된 키랄 액체 크로마토그래피 분석의 실험 결과와 잘 일치한다.

6 장에서 유도체시약으로 fluorene-2-carboxaldehyde를 사용하여 자외선 검출 하에서 순상 액체 크로마토그래피 를 이용하여 아미노 알코올을 포함한 키랄 지방족 아민의 거울상 이성질체를 처음으로 광학분리하였다. 아밀로오스 또는 셀룰로오스 계 키랄 선택자가 공유결합된 6개 키랄 고정상 및 코팅된 4 개 다당류 유래 키랄 고정상 중에서, 실험한 분석물질에 대해서 Chiralpak IE 및 Chiralpak IF 컬럼상에서는 부분적으로 또는 기준분리로 광학분리분석되었다. 특히, 셀룰로오스 유래의 키랄 고정상 는 특히 아미노 알코올 분석물에 대해 가장 우수한 광학분리를 나타내었다. 류시놀의 경우, 셀룰로오스 tris(3,5-dimethylphenylcarbamate)로 동일한 키랄 선택자가 사용된 코팅되거나 공유결합된 키랄 고정상 모두에서 가장 우수한 거울상 이성질체 분리 및 분리인자를 나타내었다. 방향족기를 함유한 α-메틸 벤질아민의 거울상 이성질체 광학분리에서도 효과적이었으며 우수한 거울상 이성질체 분리 및 분해능을 보였다. 개발된 분석법을 검증하기 위해 일중 및 일간 정확성 및 정밀성 실험이 수행됨으로, 아미노 알코올을 비롯한 키랄성 아민을 fluorene-2-carboxaldimine 유도체로 광학분리하는데 매우 정확하고 선택적임을 입증하였다.