Induction and regulation of spy transcription in Salmonella Enteritidis and Salmonella Gallinarum under envelope stress

Abstract

Maintenance of protein conformation is essential for all organisms to sustain their life in earth. The proper folding of translated proteins and the recovering damaged proteins to their functional forms are mediated by chaperone proteins. In eukaryotes, chaperones are acting mostly in cytoplasmic spaces but little is known about the existence and function of chaperones that assist the protein conformation in extracytoplasmic or extracellular spaces, which draw attention to bacterial chaperones acting exclusively in extracytoplasmic spaces. In bacterial periplasmic space, many chaperone proteins are known to assist the proper folding of proteins secreted to extracytoplasmic spaces. While most periplasmic chaperones in bacteria have much narrow substrate ranges, the membrane-stress inducible expression and crystal structure of Spy (spheroplast protein y), a periplasmic chaperone recently identified in E. coli, suggests it’s binding on a very broad range of substrate proteins under envelope-damaging conditions. However, cognate substrate proteins and the physiological roles of Spy during bacterial pathogenesis have been remained unexplored yet. This study investigated the spy gene expression and the role of Spy in intramacrophage survival for the enteric pathogen Salmonella enterica. Using the spy-gfp operon fusion constructed in two zoonotic serovars, Enteritidis (S. Enteritidis) and Gallinarum (S. Gallinarum), I found the transcription of spy in both serovars was largely induced when Salmonella were forming the spheroplast and were treated with ethanol or a membrane-disrupting antibiotic polymyxin B. These induction of spy transcription were abrogated in the mutant Salmonella lacking either of two two-component signal transduction systems, BaeSR and CpxAR that operate regulons for maintaining the envelope integrity of many gram-negative bacteria. After infection to the macrophage-like RAW 264.7 cell, spy mutation in S. Enteritidis and S. Gallinarum severely reduced Salmonella proliferation rates compared with those of their parental WT. These results illustrate that the induction of Spy expression can be efficiently triggered by two-component signal transduction systems sensing envelope stress conditions threatening bacterial survival, and thereby promotes the fitness of protein homeostasis in periplasm for Salmonella proliferation inside macrophage producing a variety of antimicrobial factors. This study also suggest that monitoring spy transcription by spy-gfp operon fusion would be very helpful to determine if developing antimicrobials can target Salmonella envelopes, and that the inactivation of Spy can be considered for developing the attenuated vaccine strain to control salmonellosis of zoonotically important S. enterica serotypes, Enteritidis and Gallinarum.|모든 생물체가 지구에서 생명을 유지하기 위해서는 단백질 구조의 유지가 필수적이다. 변성된 단백질의 적절한 접힘과 손상된 단백질을 기능성 형태로 회복시키는 것은 chaperone 단백질에 의해 매개된다. 진핵세포에서 chaperone은 주로 세포질 공간에서 작용하지만, 세포 외 공간에서 단백질 형성을 돕는 chaperone의 존재와 기능에 대해 알려진 것은 거의 없다. 반면 박테리아는 세포질 외부에서 기능하는 chaperone 단백질들을 가지고 있다. 최근 E. coli에서 확인된 주변세포질(periplasm) chaperone인 Spheroplast protein Y (Spy)의 세포질 외부로 분비되는 외막 스트레스 유도성 발현특성과 결정 구조는 막 손상 조건 하에서, 매우 광범위한 기질단백질에 작용할 것으로 예상된다. 그러나 박테리아의 병원성 발현 과정 중 Spy의 생리적 역할은 아직 밝혀지지 않고 있다. 본 연구는 장내 병원균인 Salmonella에서 spy 유전자의 발현과 대식세포 내 생존에 있어서 Spy의 역할을 조사하였다. Salmonella enterica의 두 혈청 형 Enteritidis 및 Gallinarum에서 spy-gfp 오페론 융합체를 사용하여, Salmonella가 spheroplast를 형성하고 ethanol 또는 막 파괴 항생제인 polymyxin B를 처리했을 때 spy 전사가 크게 유도된다는 것을 발견했다. 이러한 spy 전사의 유도는 많은 그람 음성균의 세포막 항상성을 유지하기 위한 regulon을 작동시키는 two-component signal transduction system (TCS) 인 BaeSR 혹은 CpxAR이 결손 된 돌연변이 Salmonella 균주에서는 현저히 감소하였다. 대식세포인 Raw 264.7 에 감염된 S. Enteritidis 및 S. Gallinarum의 spy 결손 돌연변이 균주는 야생형 균주에 비해 Salmonella 증식률이 크게 감소하였다. 이러한 결과는 Spy 발현의 유도가 박테리아 생존을 위협하는 막 스트레스인 조건을 인지하는 two-component signal transduction system (TCS)에 의해 효율적으로 유발 될 수 있음을 보여주며 다양한 항 세균 성분 인자를 생성하는 대식세포 내에서 Salmonella 증식에 필요한 주변세포질에서 단백질 항상성 유지를 촉진할 수 있음을 보여준다. 이 연구는 인수공통 감염 균주로써 중요한 S. enterica의 혈청 형인 S. Enteritidis 및 S. Gallinarum의 spy-gfp 오페론 융합체에 의한 spy 전사를 모니터링 하는 것이 Salmonella 외막을 표적으로 하는 항균제 개발의 효능을 쉽게 결정할 수 있게 하고 Spy의 비 활성화가 살모넬라증(salmonellosis)을 감소시키기 위한 백신균주 개발에 매우 유용 할 수 있음을 보여준다.