Effect of ubiquitin E3 ligase SIAH1/2 in the DNA double-strand break repair

Abstract

DNA double-strand break(DSB) repair is the most important mechanism to maintain the normal cellular homeostasis. The DSBs were repaired by two main pathway, Homologous recombination(HR) or non-homologous end joining(NHEJ). Ubiquitination is a form of protein stabilization, intracellular localization of protein, and intracellular signal at DNA damage. Although ubiquitination is commonly known as a critical mark targeting proteins for proteasome-dependent degradation, recent studies have revealed that it also has non-proteolytic functions such as activation and inactivation of target protein. Here, we report non-proteolytic function of ubiquitination by SIAH E3 ubiquitin ligase. We identify that E3 ubiquitin ligase, SIAH1 and SIAH2 are targeting BRCA2 and CtIP, respectively. We demonstrate that the E3 ubiquitin ligase SIAH mediates the target protein ubiquitination. E3 ubiquitin ligases SIAH1/2 is recruited to DNA damage site and recruitment of CtIP, BRCA2, BRCA1 and RAD51 at DSB sites following IR is dramatically decreased in SIAH1/2-deficient cells. The deletion of SIAH results in impaired HR, suppression of DNA end resection and cellular hypersensitivity to IR. Our finding reveal a role for SIAH1/2 in regulation of HR repair and maintaining genome stability, and suggest that ubiquitination of CtIP and BRCA2 by SIAH is critical for DDR.|DNA에 이중나선절단에 의한 DNA손상시 세포는 상동재결합과 비상동말단결합으로 손상이 복구되어 세포는 항상성을 유지하게 된다. Ubiquitination은 타겟단백질에 ubiquitin을 결합함으로써 프로테오좀에 의한 타겟단백질의 분해를 촉진시키고, 이로 인해 세포주기, 신호전달, 전사, 세포사멸 및 DNA손상복구등의 다양한 세포내 과정에 관여함이 알려져 있다. 그러나 최근엔 이런 단백질 Ubiquitination이 단백질 분해 촉진이 아니라 가역적 반응으로 타겟단백질의 활성을 조절함이 보고되고 있다. 따라서 본 연구에서는 대표적인 E3 ubiquitin ligase인 SIAH1/2 가 타겟단백질의 Ubiquitination을 통한 단백질 분해가 아니라 가역적으로 활성을 조절함으로써 타겟단백질에 의한 세포내 신호전달 기전을 규명하고자 하였다. Yeast two hybrid 실험을 통해 SIAH1,2 에 결합하는 DNA손상복구단백질 BRCA2와 CtIP를 동정하였고, SIAH1,2가 표적단백질의 Ubiquitination을 매개함을 보았다. 또한 SIAH1/2가 결핍된 세포에서 방사선 조사에 의한 DNA 이중나선절단시 손상 부위에 CtIP, BRCA1, BRCA2 및 Rad51 foci가 감소함을 확인하였다. SIAH1,2의 결핍은 정상세포에 비해 상동재조합에 의한 DNA손상복구 및 DNA end resection 이 저하되었으며, 방사선손상에 의한 세포 손상 민감도 또한 증가됨을 관찰하였다. 따라서 본 연구는 E3 ubiquitin ligase SIAH1/2가 DNA손상복구에 중요한 두가지 단백질인 BRCA2와 CtIP의 ubiquitination을 통해 단백질 분해가 아니라 그 활성을 조절함을 증명한 연구로 이는 SIAH단백질이 DNA손상복구 및 세포 안정성 유지에 중요한 역할을 하는 새로운 단백질 임을 밝힌 최초의 보고이다.