Development of preventive and therapeutic materials for degenerative arthritis using Anthriscus sylvestris leaves aqueous extract

Abstract

질을 분해시키며, 염증과 연골기질 분해효소 활성 증가의 반복적인 악순환을 통해 퇴행성관절염의 진행을 가속화시킨다. 현재, 관절통증을 완화시키거나 움직임을 향상시키는 등 퇴행성관절염의 증상 완화를 위해 약리학적으로는 비스테로이성 항염증제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)가 처방되거나 무릎관절 치환술과 같은 수술이 권고되고 있으나 처방되는 이러한 약들은 장기간 복용 시 퇴행성관절염 진행을 지연시키기거나 회복시키기보다는 위장 기능 약화와 신장 기능 약화와 같은 부작용을 초래한다. 따라서 퇴행성관절염을 예방하거나 진행을 지연시키고 증상을 완화시킬 수 있는 건강기능식품 혹은 약에 대한 개발 필요성이 대두되고 있으며, 최근에는 전통적인 약용식물에서 그 후보 물질을 찾으려는 노력이 증가하고 있다. 전호(Anthriscus sylvestris (L.) Hoffm.)는 산형과에 속하는 미나리과의 여러해살이풀로 유럽, 뉴질랜드와 한국 등의 산이나 들 전역에 넓게 분포해 있으며, 전호의 뿌리는 혈액순환을 좋게 하고 어혈을 풀어주며 열을 내리는 등의 효능으로 인해 예로부터 동양의학에서 다양한 질환의 치료제로 사용되어져 왔다. 전호는 많은 리그난 계열 성분과 폴리페놀 성분을 다량 함유하고 있으며, anthricin과 같은 리그난 계열은 암세포 성장 억제에 탁월한 효과가 있고, cynaroside과 chlorogenic acid과 같은 폴리페놀 성분은 항산화 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 그러나 이외에 전호잎 열수추출물의 생리활성 연구는 보고되지 않았으며, 본 연구에서는 전호잎 열수추출물(aqueous extract of Anthriscus sylvestris leaves, AE-ASL)의 항염증 효과뿐만 아니라 이 효과를 기반으로 한 염증에 대한 연골보호효과를 평가하였다. 마우스 대식세포 RAW264.7과 랫트 초대배양 연골세포에 전호잎 열수추출물을 1시간 전처리한 후 각각 lipopolysaccharide(LPS, 0.2µg/mL)와 IL-1β(20ng/mL)를 24시간동안 처리하여 염증을 유도하였다. Nitrite의 생성량은 Griess reagent로 측정하였으며, prostaglandin E2(PGE2), aggrecan(ACAN)과 collagen type II(COL2A1)의 함량은 ELISA를 통해 측정하였다. iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β, IL-6, MMP-3와 MMP-13의 mRNA 발현 수준은 중합효소연쇄반응 기법을 통해 확인하였으며, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β, IL-6, MMP-3, MMP-13, ADAMTS-4, mitogen-activated protein kinases(MAPKs)과 nuclear factor-kappa(NF)-κB의 단백 발현은 웨스턴 블랏 기법을 통해 확인하였다. 또, 염증에 의해 분해되어 나온 황산 당아미노클리칸(sulfated glycosaminoglycan)의 함량은 DMMB assay를 통해 확인하였으며, 프로테오글리칸(proteoglycan)은 알시안 블루(alcian blue) 염색을 통해 확인하였다. 생체 내 연구를 위해 항염증 효능평가는 카라기난(carrageenan)에 의한 발 부종(paw edema) 실험동물 모델을 이용하였으며, 연골보호 효능평가는 반월판 불안정(destabilization of the medial meniscus, DMM)에 의한 퇴행성관절염 실험동물 모델에 전호잎 열수추출물을 8주 동안 매일 경구투여 한 후 조직학적 검사를 수행하여 연골 파괴 및 프로테오글리칸의 손실 정도를 평가하여 그 효능을 분석하였다. 마우스 대식세포에서 전호잎 열수추출물의 전처리는 염증에 의해 증가된 nitrite와 PGE2의 생성을 감소시켰으며, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β와 IL-6의 mRNA 발현과 단백 발현 수준을 농도-의존적으로 감소시켰다. 그리고 전호잎 열수추출물은 염증에 의해 유도된 MAPKs(ERK, JNK, p38 MAPK)의 인산화를 억제하였으며, IkB-α의 인산화를 억제시킴으로써 NF-κB의 subunit인 p65의 핵으로의 이동을 억제하였다. 따라서 이러한 결과는 마우스 대식세포 RAW264.7에서 전호잎 열수추출물의 항염증 효과가 MAPKs와 NF-κB 신호전달체계에 의해 매개될 수 있음을 시사하고 있다. 카라기난에 의한 발 부종 실험에서 전호잎 열수추출물 50mg/kg, 100mg/kg, 그리고 200mg/kg을 경구투여 한 결과, 카라기난 주입 후 4시간 째에 카라기난만 주입된 군의 부종과 비교하였을 때, 50mg/kg 군에서 평균 15%, 100mg/kg에서 31%, 그리고 200mg/kg에서 40%의 부종이 억제되었다. 이 후, 전호잎 열수추출물의 항염증 효과를 기반으로 하여 랫트 초대배양 연골세포에서 염증에 대한 연골보호효과를 평가한 결과, 전호잎 열수추출물의 전처리는 염증에 의해 증가된 nitrite와 PGE2의 생성을 감소시켰으며, iNOS, COX-2, MMP-3과 MMP-13의 mRNA 발현과 단백 발현 수준을 농도-의존적으로 감소시켰다. 그리고 전호잎 열수추출물은 염증에 의해 증가된 또 다른 연골기질분해 효소인 ADAMTS-4의 단백 발현을 유의적으로 감소시켰다. 게다가, 전호잎 열수추출물의 전처리는 염증에 의한 aggrecan, collagen type II와 당아미노글리칸의 분해를 억제하였다. 염증이 유도된 랫트 초대배양 연골세포에서 전호잎 열수추출물의 연골보호 효과는 MAPKs(ERK, JNK, p38 MAPKs)의 인산화 억제와 IκB-α의 인산화 및 분해 억제를 통한 NF-κB의 subunit인 p65의 핵으로의 이동 억제에 의해 매개될 수 있음을 확인하였다. 생체 내 연구에서 전호잎 열수추출물의 연골보호효과를 검증하기 위해 DMM 수술을 받은 퇴행성관절염 실험동물에 전호잎 열수추출물을 8주 동안 매일 경구투여 한 후 조직학적 검사를 한 결과, 음용수를 받은 퇴행성관절염 실험군의 연골과 비교하여 8주 동안 전호잎 열수추출물을 받은 퇴행성관절염 실험군의 연골에서 연골 파괴가 억제되었으며 프로테오글리칸이 보호되어 있음을 확인하였다. HPLC 분석을 통해 전호잎 열수추출물에서 chlorogenic acid, cynaroside와 luteolin-7-O- malonylglucoside를 동정하였으며 이 중 cynaroside가 전호잎 열수추출물의 염증에 대한 연골보호효과에 기여하고 있음을 iNOS, COX-2, TNF-α, MMP-13, ADAMTS-4, 그리고 aggrecan의 단백발현을 통해 확인하였다. 또, 프로테오글리칸에 대한 cynaroside의 보호효과는 알시안 블루 염색을 통해 확인하였으며, 그 결과 IL-1β처리 군과 비교하였을 때 cynaroside의 전처리는 염증에 의한 프로테오글리칸의 분해를 억제하였다. 이러한 결과들은 전호잎 열수추출물이 탁월한 항염증 및 연골보호효과를 가지고 있으며 이는 퇴행성관절염의 진행을 완화시키기 위한 예방 및 치료제로써 강력한 잠재력이 있음을 보여준다. 또, 이러한 전호잎 열수추출물의 효과는 향후 퇴행성관절염 예방 및 치료제로써의 개발 가능성을 시사한다.