Activation of the Blood Complement System by a Vibrio Extracellular Protease

Abstract

Vibrio vulnificus (V. vulnificus) is a causative agent of serious food-borne diseases in humans related to the consumption of raw seafood. It is a pathogenic bacterium that causes wound infection and septicemia. Most of fatal diseases in human are caused by septic shock, which is resulted from various virulence factors, including capsular polysaccharide and lipopolysaccharide secreted by the bacterium. In this laboratory, a broad-specificity extracellular metalloprotease (called vEP-45) has been purified and characterized from V. vulnificus ATCC29307. The protease can interfere with blood homeostasis through prothrombin activation and fibrinolysis. Furthermore, vEP-45 can activate the plasma contact system by cleaving key zymogen molecules, participating in the intrinsic pathway of coagulation and the kallikrein/kinin system. It has been known that the complement and coagulation systems are closely linked to maintain blood homeostasis. However, to date there are no evidences whether vEP-45 protease can activate the blood complement system. Therefore, the present study was performed to elucidate the roles of vEP-45 both on the activation of the complement system and on the population sizes of neutrophils and monocytes in mouse. The results obtained were as follows: vEP-45 could proteolytically convert the complement precursor molecules C3, C4, and C5 to their respective active forms (C3a, C3b, C4a, C4b, C5a, and C5b) in vitro as shown by sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The Western blot analyses also showed that C3b and C3a could be produced from the precursor C3 by vEP-45 cleavage dose-dependently. The generations of C4b and C4a from C4 peaked at 50 and 200 ng of vEP-45 treatments, respectively, accompanied with gradual decreases at higher concentrations. The complement molecule C5a also was produced from C5 by vEP-45 in a dose-dependent manner, although C5b band could not appear clearly on the blot. These results suggest that vEP-45 can proteolytically activate the blood complement protein molecules. In this study, the ability of vEP-45 to activate the complement proteins contained in human plasma was also confirmed by Western blottings. The results showed that vEP-45 can increase the production levels of C3b and C3a by approximately 267% and 70%, respectively, in dose-dependent manners. The enzyme could increase dose-dependently the production level of C5a by approximately 266%, compared with that of non-treated control, although the C5b band could not be observed as in in vitro cleavage assay. These results suggest that vEP-45 can convert plasma C3 and C5 complement factors to their respective active factors, even in the plasma milieu. The effects of vEP-45 on the number of cells of immune cells such as neutrophils and monocytes were also examined in vivo by flow cytometry. The results showed that vEP-45 could increase the population sizes of such immune cells by an average of 32%. All these results obtained by the present study demonstrate that vEP-45 can activate the complement system to potential innate immunity.|Vibrio vulnificus(V. vulnificus)균은 해산물을 날 것으로 섭취했을 때 유발되는 비브리오 폐혈증의 원인균이다. 일반적으로 비브리오와 같은 병원성 세균들은 금속-함유 단백질 분해효소(metalloprotease)를 비롯한 capsular polysaccharide, lipopolysaccharaide 등을 분비한다. 본 연구실은 V. vulnificus ATCC29307 균주로부터 분비되는 단백질분해효소(vEP-45로 명명됨)를 암호화하는 유전자를 클로닝하여 염기서열을 분석하였으며, 이 유전자를 대장균에서 과발현시킨 후 순수분리하여 그 생화학적 특성을 규명한 바 있다. vEP-45는 프로트롬빈(prothrombin)을 트롬빈(thrombin)으로 활성화시킬 뿐만 아니라 교차 연결된 피브린(cross-linked fibrin)을 분해하여 혈액의 항상성을 교란시킨다. 또한 이 효소는 혈액 응고의 내인성 경로(intrinsic pathway)에 작용하는 FXII 등 다양한 zymogen들을 절단함으로써 혈장 접촉계(plasma contact system)를 활성화시킬 수 있다. 혈액 보체계(blood complement system)와 응고계(blood coagulation system)는 서로 밀접하게 연관되어 있으며, 이들의 활성화는 혈액의 항상성 유지에 매우 중요하다. 따라서 혈액 응고계와 접촉계를 활성화시키는 vEP-45에 의한 혈액 보체계 활성화 여부 및 선천성 면역(innate immunity)에 미치는 영향을 규명하는 연구는 병원성 세균이 분비하는 단백질분해효소의 기능을 근본적으로 이해하는데 있어 매우 중요하다. 본 연구에서는 비브리오 감염 시 분비되는 vEP-45에 의한 보체계와 면역세포의 활성화 여부를 분석함으로써 이 단백질분해효소에 의한 선천성 면역기능의 변화를 규명하고자 하였다. 본 연구를 통해 얻은 주요결과는 다음과 같다. 시험관 내에서 인간 보체계 전구분자들(C3, C4 및 C5 등)을 vEP-45로 절단한 결과, 이들의 활성화된 형태인 C3a/C3b, C4a/C4b 및 C5a/C5b가 생성됨을 sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)로 확인하였다. 이러한 결과는 Western blot 분석으로도 재확인하였다. Western blotting 결과, C3a/C3b의 생성은 vEP-45 농도 의존적으로 증가하였으며, C4b 및 C4a는 각각 50 및 200 ng의 vEP-45를 처리했을 때 가장 높게 생성됨을 확인하였다. Western blot 상에서 C5b band는 관찰되지 않았으나, C5a의 생성은 vEP-45 농도-의존적임을 확인하였다. 이러한 vEP-45에 의한 보체계 인자들의 활성화가 혈장 내에 존재하는 보체들로 부터도 일어나는지를 Western blotting으로 확인 하였다. 그 결과, vEP-45 처리농도에 비례하여 C3a와 C3b가 267% 및 70%로 각각 증가하며, C5a는 약 266% 증가함을 확인하였다. 그러나 시험관 내 실험결과와 동일하게 이 경우에도 C5b band는 확인할 수 없었다. 이러한 결과들은 vEP-45가 혈장 내에 존재하는 C3와 C5를 잘라 C3a/C3b 및 C5a/C5b로 각각 활성화시킬 수 있음을 시사한다. 이러한 vEP-45에 의한 보체계 활성화가 선천성 면역반응에 어떤 영향을 미치는지를 분석하기 위해 vEP-45를 주사한 생쥐에서 호중구 및 단핵구 세포 수를 형광-활성 세포 선별기(fluorescence-activated cell sorter, FACS)를 이용한 flow cytometry로 분석하였다. 그 결과, vEP-45는 호중구와 단핵구 세포를 평균 약 32% 증가시킴을 확인하였다. 이상의 결과들은 vEP-45가 비브리오 감염 시 혈액 보체계와 선천성 면역반응을 활성화 시킬 수 있음을 시사하는 것이다.