Coumestrol에 의한 FaDu 인후두암세포 사멸 및 세포 생체 신호전달기전

Abstract

인후두암은 일반적으로 구강의 점막 내층에서 발생하며, 대부분 조기 발견이 어렵고 치유율이 낮은 반면 사망률이 매우 높은 암으로 알려져 있다. 현재 임상에서 사용되는 항암 화학 요법제(Chemotherapeutic reagent)는 메스꺼움, 구토, 구내염, 설사 및 골수 기능 장애와 같은 다양한 부작용을 동반함에 따라 부작용이 적으며 암 특이적 세포사멸 유도가 가능한 효과적인 항암 화학 요법제 개발이 절실히 요구되어진다. 최근 부작용이 적은 항암 화학 요법제 개발과 관련하여 생물학적 안전성과 다양한 약리학적 효과를 나타내는 자연에서 유래된 유사체 에스트로겐(Phytoestrogen)에 대한 관심이 높아지고 있는 추세이다. 유사체 에스트로겐은 항산화 및 항염증 등 다양한 생리학적 효능에 대한연구가 보고되고 있을 뿐만 아니라 다양한 암에서 효과적인 항암활성이 보고되고 있다. Coumestrol은 coumestans 계열의 천연 유기 화합물로 클로버, 시금치, 브루셀스프라우트(Brussels sprouts) 및 콩 등 다양한 식용 가능 식물에 포함된 기능성 물질로 알려져 있다. 최근 coumestrol은 유방암, 전립선 암 및 폐암과 같은 다양한 종류의 암에서 항암 효과가 보고되었지만, 암 세포 사멸 및 전이 억제와 같은 항암 효과는 인후두암에서 아직 조사되지 않았다. 따라서, 본 연구의 목적은 coumestrol의 생물학적 안전성을 분석하고, 이를 토대로 FaDu 인후두암세포에서 항암효능 및 이와 관련된 기전을 분석하여, 최종적으로 생체 내 인후두암에 대한 항암효능을 분석하고자 한다.

Coumestrol의 세포독성을 평가하기 위하여 FaDu 인후두암세포를 10% (w/v) Fetal Bovine Serum (FBS, Life Technologies, Grand Island, USA)이 포함된 Minimum Essential Medium (MEM, Life Technologies, GRAND Island, NY, USA)배지를 이용하여 5% 의 CO2가 유지되는 37℃ CO2 배양기에서 24 시간 배양하여 사용하였다. Coumestrol으로 처리하여 MTT assay 및 Cell live & dead assay를 수행하여 각각 세포 독성 및 세포생존율을 분석 하였다. Hematoxylin & Eosin 염색법, DAPI 염색법, DNA 단편화(DNA fragmentation) 분석을 사용하여 각각 아폽토시스소체(apototic body) 형성, 핵 응축 및 DNA 분절현상 등 아폽토시스(Apoptosis)와 관련된 세포사멸 현상을 분석하였다. 또한, 유세포 분석(Fluorescence activated cell sorter)을 이용하여 coumestrol에 의한 FaDu 인후두암세포의 아폽토시스를 검증하였다. Western blot과 caspase-3 /-7 activity assay를 이용하여 아폽토시스 및 이와 관련된 세포 신호 전달 경로를 분석하였다. 콜로니 형성(colony formation), 트랜스 웰 분석 및 상처 치유(wound healing)분석을 수행하여 각각 증식(proliferation), 침입(invasion) 및 이동(migration)을 분석하였다. 최종적으로, FaDu 인후두암세포 이식을 통하여 제작된 동물모델을 활용하여 coumestrol에 대한 생체 대상 항종양 효과 및 이에 대한 기전을 면역조직화학법(immunohistochemistry)을 수행하여 분석하였다.

Coumestrol은 FaDu 인후두암세포 사멸을 유의하게 증가 시켰으며, 정상 사람 구강 각화 세포(human normal oral keratinocyte)의 생존력에는 영향을 미치지 않았다. Coumestrol으로 48시간 동안 FaDu 인후두암세포를 처리 할 때 형태학적 변화와 핵응축, DNA 분절화, 세포 사멸 개체군의 증가와 같은 아폽토시스의 전형적인 특성이 증가했다. 또한, coumestrol은 FaDu 인후두암세포에서 세포사멸유도인자인 FasL의 발현을 용량 의존적으로 유의하게 증가시켜 이의 하위 세포사멸인자인 caspase-8을 활성화를 통한 외인성세포사멸경로(death receptor- mediated apoptosis) 매개됨을 확인하였다. 뿐만 아니라 활성화된 caspase-8에 의하여 세포사멸인자인 Bid를 tBid로 활성화하여 Bax 및 Bad 등의 발현증가 및 세포사멸억제인자인 Bcl-2 및 Bcl-xL의 발현을 감소시킴으로써 미토콘드리아 막 전위(mitochondria membrane potential)을 감소시켜 cytochrom c를 세포질로 분비시킴으로써 caspase-9 활성화를 통한 미토콘드리아 의존 내인성 세포사멸 (mitochondria dependent intrinsic apoptosis)에 의한 FaDu 인후두암세포 사멸이 매개됨을 확인하였다. 최종적으로 활성화된 각각의 외인성 및 내인성 세포사멸인자인 caspase-8 및 caspase-9에 의한 단계적인 caspase-3 및 poly ADP ribose polymerase (PARP)의 활성화가 매개됨을 확인하였다. 또한, caspase inhibitor인 Z-VAD-FMK를 이용하여 caspase 활성억제에 따른 coumestrol의 caspase 의존적인 세포사멸현상임을 확인하였다. 특히, 본 연구에서는 coumestrol에 의해 유발된 FaDu 인후두암세포 사멸은 ERK1/2 및 p38을 포함하는 mitogen-activated protein kinase (MAPK)의 인산화를 억제시킬 뿐만 아니라 Akt-mTOR 세포신호전달경로를 통한 p-53 발현 상향 조절에 의해 매개되었다. 또한, 본 연구에서는 암세포 증식 및 이동과 관련된 중요한 인자인 matrix metalloproteinase (MMP)-2 및 MMP-9 발현과 활성이 coumestrol 농도의존적으로 억제됨으로써 FaDu 인후두암 세포의 증식, 이동 및 침입이 억제 또는 지연되는 coumestrol의 암세포 전이 억제 효능을 확인하였다. 최종적으로 coumestrol에 의한 세포사멸, 암세포 증식 및 전이 억제효능에 대한 생체 내 효능을 분석한 결과 FaDu 인후두암세포가 이식된 종양동물모델에서 유의하게 종양형성이 억제됨을 확인하였다. 종양동물로부터 회수된 종양조직에 대한 면역조직화학적 분석을 시행한 결과 coumestrol 경구 투여된 종양 내 Akt의 인산화가 억제되어있는 반면, 대표적인 종양억제인자인 p53의 발현이 유의적으로 증가되어있음을 확인하였다. 이러한 연구결과를 토대로 coumestrol은 FaDu 인후두암종에서 내인성 및 외인성세포사멸경로를 통한 세포사멸을 유도할 뿐만 아니라 Akt-mTOR 및 MAPK 신호전달경로를 통하여 종양억제인자인 p53의 발현증가를 통하여 암세포의 증식 및 전이를 억제시키는 다양한 항종양효능이 in vitro 및 in vivo 연구에서 확인되었다. 따라서, 이러한 결과는 coumestrol 두경부 인후두암종 치료를 위한 생물학적 안전성 및 우수한 항암효과가 확보된 화학 치료제 후보물질임을 제시하고 있다.|I. Introduction Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) have been reported annually about over 640,000 new cases and account for 4% of all cancer death in worldwide. Although clinical treatment of oral cancer such as surgery including incision and cryotherapy, non-surgical treatment such as radiotherapy, and chemotherapy are performed, but it is still known that there is a risk of recurrence in addition to serious side effects. Many studies have been reported that coumestrol has an anti-inflammatory and antioxidant properties. Furthermore, even though anti-cancer effects of cumestrol have been reported in various types of cancers, but its anti-cancer effects including apoptosis and the inhibition of metastasis is still not investigated in the HNSCC.

II. Objectives The purpose of this study was to determine whether coumestrol could function as a chemotherapeutic agent for HNSCC.

III. Materials & Methods Cell cytotoxic effect of coumestrol on FaDu cells was measured by 3-(4-, 5-Dimethylthiazol-2-yl)-2, 5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT, Life Technologies, Grand Island, NY, USA) assay. Cell Live & Dead assay (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA), which is composed of green calcein AM to stain the live cells with green fluorescence and ethidium homodimer-1 to stain the dead cells with red fluorescence. DAPI staining was performed to detection of cells with condensed nucleus, which is a apoptotic phenomenon. Flow cytometric analysis (FACS) was performed to detect apoptosis using co-stained with annexin V-FITC and propidium iodide (PI) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Western blot analysis was performed to examine the coumestrol induced death receptor mediated extrinsic and mitochondria dependent-intrinsic apoptosis pathway in FaDu cells.In order to observe the inhibition of migration of FaDu cells migration was photographed after 24 and 48 h of coumestrol treatment. The colony formation assays were performed to observe the effects of coumestrol on the growth ability of FaDu cells. FaDu cells were treated with 5 μM, 10 μM coumestrol for 24 h and then were incubated in the culture media without coumestrol for 7, 10 days.

IV. Results Coumestrol increased the cytotoxicity of FaDu cells, but it did not affect the viability of hNOKs. Furthermore, typical characteristics of apoptosis such as the formation of apoptotic body, condensed chromatin, the fragmentation of genomic DNA were increased in the FaDu cells treated with coumestrol for 48 h. Furthermore, FACS analysis using annexin V and propidium iodide showed that the apoptotic populations were significantly increased in the FaDu cells treated with coumestrol as a dose-dependent manner. These data indicate that coumestrol-induced FaDu cell death was involved with apoptosis. Sequentially, coumestrol increased the expression of cleaved caspase-8 through the up-regulation of the expression of FasL in FaDu cells. Moreover, expressions of pro-apoptotic factors associated with mitochondria dependent apoptosis such as Bik, Bim, Bad, and Bax and tumor suppressor p53 were increased in the FaDu cells treated with coumestrol. Whereas, expression of anti-apoptotic factors associated with mitochondria dependent apoptosis such as Bcl-2 and Bcl-xL were decreased in FaDu cells treated with coumestrol. Sequentially, the expression of cleaved PARP was increased though the increased activity and expression of cleaved caspase-3 in the FaDu cells treated with coumestrol. The suppression of the Akt-mTOR axis, and down-regulates MAPK phosphorylation were observed in the FaDu cells treated with coumestrol. These results indicate that coumestrol-induced FaDu cell death is mediated by both death receptor-mediated extrinsic and mitochondria-dependent intrinsic apoptosis pathways through the modulation of Akt-mTOR and MAPK cellular signaling pathways. In addition, the migration and proliferation of FaDu cells were significantly decelerated by coumestrol. Furthermore, expressions and activations of matrix metalloproteinase such as MMP-2 and MMP-9 on and activation of MMP-2 and MMP-9 significantly decreased in the FaDu cells treated with coumestrol.

V. Conclusion Taken together, these findings indicate that coumestrol has potential chemopreventive effects and is capable for use as a chemotherapeutic agent for pharyngeal squamous carcinoma.