애기장대 근관의 경계세포에서 발현되는 세 가지 zinc-finger 단백질 유전자들의 특성 규명

Abstract

애기장대의 발달을 조절하는 신규 유전자의 선별하기 위하여 근단에 특이적으로 GAL4 전사인자를 발현하는 Q2610 인핸서 트랩 라인에 UAS 활성표지를 도입하여 무작위적으로 인접한 유전자의 과대발현을 유도하였다. 형질전환체 중에서 뿌리가 짧고 뒤틀리며 표피 세포의 패턴에 이상이 나타난 식물을 선별하였고, 이를 defective root development2-D (drd2-D)라고 명명하였다. Thermal asymmetric interlace-PCR (TAIL-PCR)을 활용하여 UAS 활성 표지를 포함한 T-DNA가 AT1G02030 (ZAT1) 유전자의 잠정적인 개시 코돈에서 133bp 상류 지역에 위치한 것을 확인하였다. ZAT 1은 세 개의 C2H2 유형의 zinc finger (ZF) 모티프를 포함하는 ZF 단백질을 암호화하고 있었다. RT-PCR을 수행한 결과 drd2-D의 배경하에서 ZAT1의 발현은 높은 수준으로 향상되었다. 또한, Q2610>>ZAT1 형질전환 식물을 제조한 결과 drd2-D의 표현형이 재현되는 것을 확인하였다. 이와 같은 결과들은 drd2-D의 표현형이 ZAT1의 과대발현에 의해 유래한 것임을 제시한다. ZAT1의 프로모터에 의해 조절되는 리포터 유전자들은 근관의 최외각 경계세포, 내피 세포층, 관다발 세포층 그리고 수공 등 성숙이 진행되는 조직에서 발현되었다. 근관의 세포층이 증가한 sombrero (smb)돌연변이와 SMB가 과대발현된 돌연변이 식물에서 근관의 최외각 층에 특이적인 ZAT1의 발현 패턴은 변화하지 않았으며, 이러한 결과는 ZAT1의 발현은 SMB에 비의존적이라는 것을 의미한다. ZAT1 과대발현 배경하에서 WOX5와 CYCB1;1 유전자의 발현이 약화되었는데 이는 ZAT1이 정지중심부의 정체성을 약화시키고 세포분열을 억제한다 것을 의미한다. 반면에 ZAT1 과대발현 배경하에서 SMB와 CEL5 리포터 유전자의 발현 패턴이 유지되었는데 이는 ZAT1의 과대발현이 근관세포의 정체성을 변화시키지 않는다는 것을 의미한다. 애기장대에는 두 개의 ZAT1 유사 유전자인 At3g60580와 At2g45120가 존재하며, 각각 ZAT9와 ZAT4라고 명명되었다. 이들 유사 유전자들의 기능을 이해하기 위하여 Q2610>>ZAT9와 Q2610>>ZAT4 과대발현 형질전환식물을 준비하였으며 이들은 Q2610>>ZAT1과 마찬가지로 유식물의 생장을 강하게 억제하였다. ZAT9과 ZAT4의 프로모터는 공통적으로 근관의 경계세포에서 발현되었으며, ZAT4의 경우 뿌리털세포, 자엽과 본잎의 기공세포, 그리고 꽃가루에서도 발현되는 것을 관찰하였다. 흥미롭게도 자신의 프로모터에 의해서 발현된 ZAT9-GFP와 ZAT4-GFP는 근관의 다른 세포층에서도 관찰되었으며 이러한 결과는 ZAT9와 ZAT4가 이동할 수 있음을 암시한다. 세 가지 관련된 ZF 유전자들이 공통된 발현 패턴과 기능은 세 유전자들이 근관의 최외각 세포의 성숙 과정에 공통된 역할을 담당할 것이라는 것을 제시한다. 그렇지만 zat1; zat4; zat9 삼중돌연변이의 경우 뿌리에서 명확한 표현형을 나타내지 않았다.|To screen for genes regulating the root development of Arabidopsis, UAS activation tags were introduced into the background of Q2610 where GAL4 transcription factors are highly expressed leading to the random overexpression of genes neighboring to the tags. A dominant mutant developing short and twisted root was isolated and designated as defective root development 2-D (drd2-D). The T-DNA containing the UAS tag was localized at the 133 base-pair upstream of the putative start codon of At1g02030 (ZAT1) by using thermal asymmetric interlace-PCR. ZAT1 encodes a zinc finger (ZF) protein containing three C2H2 ZF motifs. The reverse transcription-PCR (RT-PCR) analysis revealed that the ZAT1 expression was upregulated in drd2-D. In addition, Q2610>>ZAT1 transgenic lines recapitulated the drd2-D phenotype. These results suggest that drd2-D was induced by ZAT1 overexpression. The expression of reporter genes driven by the ZAT1 promoter was observed in the tissues undergoing maturation such as border cell of root cap, endodermis, vasculature, and hydathodes. The border-cell specific expression pattern of ZAT1 was not altered in sombrero (smb) accumulating additional root cap layers and SMB-overexpressing mutant suggesting that ZAT1 expression is independent of SMB. WOX5 and CYCB1;1 expression was down-regulated in ZAT1-overexpression lines suggesting that ZAT1 compromises the identity of quiescent center and suppresses cell divisions. On the other hand, SMB and CEL5 expression pattern was not altered in ZAT1-overexpression background suggesting that ZAT1 could not change the identity of root cap tissues. There exist two ZAT1-related genes, At3g60580 and At2g45120 in Arabidopsis named ZAT9 and ZAT4, respectively. To understand their functions, Q2610>>ZAT9 and Q2610>>ZAT4 transgenic lines were prepared and exhibited strong growth defects of seedlings like Q2610>>ZAT1. Both ZAT9 and ZAT4 promoters were active in the root cap border cells. In addition, ZAT4 promoter was also active in the root hair cells, stomatal guard cells, and pollens. Interestingly, ZAT9-GFP and ZAT4-GFP expressed their own promoters were also found in the other layers of root cap suggesting that ZAT9-GFP and ZAT4-GFP might be mobile. These shared expression pattern and function of three related ZF genes suggest that they might possess shared roles in the border cell maturation in the root cap. However, zat1 zat4 zat9 triple mutant showed no apparent phenotype in the root.