The Study on the Changes of Bacterial Inorganic Phosphate Metabolism in Interactions between Nitric Oxide and Salmonlla enterica serovar Typhimurium

Abstract

병원성 세균의 성공적인 감염을 위해서는 숙주 식세포에 의한 산화질소 스트레스의 내성이 필수적이다. 이전 연구에서 Salmonella의 산화질소 내성에 세균 내부의 무기인 항상성이 중요하다는 사실이 밝혀진 바 있다. 본 연구에서는 S. Typhimurium에 산화질소(NO)를 처리하였을 때 전체 세포의 인 함량은 변함 없지만 세포 내 자유 무기인의 농도가 감소하는 현상을 발견하였다. 이는 세균 세포 내부에서 NO와 무기인이 상호작용하고 있음을 시사한다. 이러한 NO와 무기인의 상호작용에서 세포 내부 인 화합물의 변화를 관찰하기 위해 31P NMR spectroscopy를 수행하였다. 먼저 S. Typhimurium의 야생형 균주에 산화질소 공여체인 sperNO를 처리하여 31P NMR spectra를 관찰하였다. 그 결과 알려지지 않은 NO에 의한 새로운 인 화합물의 존재를 확인하였다. 이러한 NMR spectra 변화가 세포 내부 어디에서 일어나는지 알아보기 위해 spheroplast를 형성시켜 cytoplasm과 periplasm 에서의 31P NMR spectra를 확인해보았고 그 결과 새로운 인 화합물은 periplasm에 존재하는 것으로 확인되었다. 세포질 내로 무기인을 원활히 수송하지 못하는 Δpst operon pitA 결손 돌연변이주로 31P NMR spectra를 확인했을 때 야생형 균주에서 확인된 인 화합물은 관찰되지 않았고 ΔpitA 결손 돌연변이주에서는 다시 관찰되었다. 이 결과는 pst operon에 의존적인 변화라고 판단된다. periplasm에 존재하며 무기인 수송을 담당하는 무기인 결합 단백질 PstS가 주요한 역할을 할 것으로 판단되어 ΔpstS 결손 돌연변이주로 31P NMR spectra를 확인하였고 인 화합물이 관찰되지 않는 것을 확인하였다. 그러나 ΔpstS 돌연변이주에 pstS 클론을 도입해 확인해 본 결과 새로운 인 화합물의 존재는 다시 나타나지 않았다. 이것은 아직 규명되지 않은 Pst 수송 복합체의 메커니즘이 연관되어 있는 것으로 보인다. 종합해보면 pst operon이 NO에 의한 새로운 인 화합물의 존재와 연관되어 있음을 확인하였고 이 인 화합물은 현재까지 알려지지 않았다. 향후 연구를 통해서 이 인 화합물의 특성을 규명하고 관련 메커니즘을 연구할 필요가 있다.|For successful infection of pathogenic bacteria, tolerance to nitric oxide (NO) stress produced by host macrophages is essential. Previous studies have shown that inorganic phosphate (Pi) homeostasis is important for nitric oxide tolerance of Salmonella. In this study, I have found that, when S. Typhimurium were treated with NO, the concentration of intrabacterial free phosphate is reduced while levels of total phosphorous contents in Salmonella are unchanged. This result suggest that NO and inorganic phosphate may interact in Salmonella in vivo. 31P NMR spectroscopy was employed to observe the phosphorous compounds in Salmonella during NO treatment. The result spectra present chemical shift of peaks corresponding orthophosphate and also presents new peaks of phosphorous compound unidentified so far. In order to check where these new peaks of unidentified phosphorous compounds come from inside the cell, contents of cytoplasm and periplasm were isolated by cold osmotic shock procedure. The result shows that these new peaks of NMR spectra are derived from periplasmic space in Salmonella. In order to get increased amount of these new phosphorous compounds for further study, I have used Δpst operon pitA mutant Salmonella lacking major orthophosphate transporter Pst and Pit systems. Because it has been known that most of free phosphate in periplasmic space are transported in to cytoplasm by Pst and Pit. Unexpectedly, these new NO specific peaks disappear in the Δpst operon pitA double mutant, but in the ΔpitA single mutant, these peaks were observed, suggesting that these phenomenon is related with Pst transport system. In Pst transport system, PstS is the Pi binding protein that transport Pi in periplasm into Pst transport complex, so expected to play an important role in forming the new NO specific peaks in periplasm. 31P NMR spectra of ΔpstS mutant also did not present the new peaks. However, ΔpstS mutant harboring complementing pstS clone was not able to present these NO specific peaks. This seems to be related to the not yet identified mechanism of the Pst transport complex. In conclusion, I have found that Pst transport system is associated with the new phosphorous compounds formed by NO in periplasmic space of bacteria. Future research will be needed to characterize these phosphorous compounds and related mechanisms.