Optimization of methanol synthesis from methane by Methylomonas sp. LM6, a newly isolated and characterized strain from rice paddy soil

Abstract

메탄 산화 박테리아(MOB)라고도 불리는 Methanotroph는 호기성 또는 미호기성 조건에서 메탄을 탄소와 에너지의 유일한 원천으로 사용하는 박테리아 그룹이다. 그들은 메탄과 이산화탄소의 물질 대사를 위한 일반적인 경로를 공유하며 메탄 대사의 첫 번째 단계는 메탄산화효소(MMO)를 통한 메탄을 메탄올로의 산화이다. 따라서 MOB는 화학 물질 및 지속 가능한 재생 에너지 생산을 위해 쉽게 재생 가능한 탄소원인 메탄의 생물공학적 이용에 큰 가능성을 가지고 있다. 최근에, 이 특별한 능력은 응용되는 미생물 학자들과 생화학 엔지니어들에게 많은 관심을 받고 있다. 논에서 메탄 산화세균이 분리되어 특성이 규명되었다. 그람 음성, 운동성 및 pink-orange 색소가 있는 종이다. 세포의 형태는 짧은 로드(약 1.3X0.73µm)였고 단일 또는 때때로 쌍으로 나타났다. 최적온도는 27-30℃이고 40 ℃까지 자랄 수 있으며, pH범위는 5.0-8.0이고 최적 범위는 5.5-7.0이다. 비 성장 속도 및 생성 시간은 0.07h-1 및 9.48h인 것으로 나타났다. 16Rdna 염기서열 분석 결과에 의하면 분리균주 (NCBI accession number KX774627)는 Gammaproteobacteria계열의 Methylococcaceae에 속하였고 Methylomonas koyamae와 가장 밀접하게 관련되어 97%의 유전자 서열 상 동성을 보였다. 또한 주요 세포 지방산은 C14:0, C16:1 w5c and C16:0 이었다. 따라서 형태학적, 생리학적, 분자적 및 계통 학적 특성에 기초하여, 이 균주는 Methylomonas 속의 새로운 균주를 나타내는 것으로 간주되며 Methylomonas sp. LM6 으로 명칭이 붙여졌다. Methylomonas sp. LM은 메탄과 메탄올을 유일한 탄소와 에너지원으로 자라는 절대적인 메탄영양세균이다. 여기서 우리는 Methylomonas sp. LM6의 양질의 유전체 서열을 보여 주었다. 56.43 %의 G + C 함량을 가진 염색체 (4,894,002 bp)와 플라스미드 (186,658 bp)로 구성되어있다. 총 4,490개의 유전자가 이 균주의 게놈에서 예측되었으며, 이 중 4,337개는 단백질 코딩 유전자이고 단백질 코딩 영역의 총 길이는 4,432,392bp이다. 2,779개의 단백질 코딩 유전자가 추정 기능에 할당되었고, 나머지는 가상의 단백질로 주석 처리되었다.또한 Methylomonas koyamae형 균주 JCM 16701 (NZ_BBCK01000001)과 LM6사이의 게놈 거리는 양방향 평균 뉴클레오티드 동일성을 기준으로 97.0%로 추정되었다. 이 값은LM6균주가 Methylomonas koyamae 종에 속한다는 것을 보여준다. LM6균주는 메탄을 메탄올로 산화시키는 미립자 메탄산화효소(pMMO)를 암호화하는 2개의 미립자 메탄산화세균 오페론 (pmoABC, XXXX_3758-XXXX_3760; pmoCAB, XXX_3996-XXXX_3998)을 보유하고 있지만 가용성 메탄산화세균 오페론은 이 게놈에서 발견되지 않았다. 이 연구는 또한 메탄으로부터 메탄올 생합성에 대한 접근법을 연구하였다. 메탄올 생산은 생체촉매제인 Methylomonas sp. LM6의 전체 세포를 이용하여 수행되었다. 박테리아 세포를 이용한 메탄-메탄올 전환은 고비용의 화학 공정을 대체하기 위해 수행되었다. 또한 생물학적 전환은 상온에서 수행되고 환경 친화적인 공정으로 높은 전환 효율로 수행되므로 에너지를 덜 필요하므로 장점이 있다. MMO는 메탄의 메탄올로의 산화를 촉매 하는 주요 효소이다. Methanotrophic 박테리아는 메탄올 탈수소효소(MDH)의 활성을 억제함으로써 메탄올을 축적할 수 있다. 이 연구에서 새로 분리된 Methylomonas sp. LM6의 세포를 생체 촉매로 사용하여 메탄으로부터 메탄올을 생체 전환시키는 방법을 연구하였다. 세포를 단단히 밀봉 된 삼각 플라스크에 methane/air (6:4, v/v) 혼합물을 공급하여 질산 미네랄 염(NMS)배지에서 배양하였다. 성장을 위한 최적의 pH와 온도는 각각 pH 7.0과 30℃이고, 구리 농도는 2 μM이다. 세포를 원심분리에 의해 수확하고 20 mM 인산 완충액 (pH 7.0)을 사용하여 3회 세척하였다. 메탄올을 생산하기 위해서는 MDH 활성이 저해 되어야 한다. 따라서 MDH 억제제로 60 mM of potassium phosphate, 60 mM of MgCl2, 90 mM of NH4Cl, and 3 mM of EDTA 를 사용하고 최대 메탄올 합성을 위해 methane/air (6:4, v/v) 혼합물이 공급된 10 mL NMS배지 (pH 7.0)를 함유한70mL serum bottle에 넣었다. 반응 온도는 30℃를 유지하였으며, 반응 혼합물 중의 첨가된 세포 농도 및 Na-formate 는 0.68 mg dry cells wt / mL및 80mM이었다. 24시간 반응 동안, 11.3mM의 메탄올이 반응 혼합물에 축적되었다. 또한, potassium phosphate, MgCl2, NH4Cl and EDTA와 같은 여러 가지 MDH 억제제의 매개 변수 및 상승 효과를 더욱 최적화하여 최대 22.8mM의 메탄올 축적을 크게 개산하였다. 또한 이 연구에서 주요 과제 중 하나는 반응 혼합물에서의 메탄 가스 가용화의 증진이다. 따라서 메탄 용해도를 향상 시키지만 세포 성장을 억제하지 않기 위해 여러 유기 용매를 시험 하였다. 1-octanol은 세포 성장 억제 없이 가스와 수성 단계 사이의 메탄 가스 전달을 증가시킴으로써 메탄올 합성을 향상시키는 가장 효과적인 용매였다. 이전 연구에서, Methylomonas sp. LM6에 의한 회분식 반응에서의 최대 메탄올 축적은 22.8mM이었다. 이 연구에서 1-octanol 이 반응 매질에 첨가 될 때 메탄올 생성이 유의하게 증가한다는 것을 발견했다. 100 mL의 NMS 반응 혼합물 (pH 7.0)과 2 mL의 1-octanol 이 들어있는 500 mL 삼각 플라스크에 메탄 / 공기 (6 : 4, v / v)를 공급하고 180 rpm으로 30 ° C에서 8 시간 동안 교반 하였다. 1- octanol 을 제거한 후, 고 메탄 농축 반응 혼합물을 MDH 억제제로서 90mM NH4Cl, 80mM Na- formate 및 0.68mg dry cells / mL뿐만 아니라 60 mM potassium phosphate, 60 mM MgCl2, and 3 mM EDTA로 처리하였다. 반응 혼합물을 추가의 메탄 없이 24 시간 동안 30 ℃에서 배양 하였다. 그 다음, 생성 된 메탄올 농도는 22.8mM에서 50.1 mM로 증가했다. 1- octanol 은 세포 활성을 억제하지 않았고 반응 혼합물로부터 회수되어 추가 실험을 위해 재사용되었다. 이러한 결과는 1- octanol 이 80.03 mM에서 130.80mM의 메탄 용해도를 대조군에 비해 약 1.6 배 증가 시켰으며 대조군 (1- octanol 제외)에 비해 메탄올 생산량을 약 2 배 증가 시킨다는 것을 보여준다. 메탄 가용화 제로서 1- octanol 을 사용하는 메탄올로의 메탄 생체 전환은 효과적인 방법이며 산업적 응용에 사용될 가능성이 있다고 결론 지었다.