인간 피부 섬유아세포에서 항노화 및 autophagy 활성화에 미치는 네오엔돌핀의 영향에 관한 연구

Abstract

Skin aging is influenced by several genetic, physiological and environmental factors, among which solar ultraviolet (UV) irradiation is one of the most important causes for skin photoaging. Autophagy, a process that maintains homeostatic balance between the synthesis, degradation, and recycling of cellular organelles and proteins, plays an important regulatory role in differentiation, development, stress, diseases, cancer, and aging. Recent studies have reported that the increased autophagy can delay aging and also extend longevity. One of opioid neuropeptides, α-neoendorphin (NEP) is an endogeneous decapeptide (N-YGGFLRKYPK-C) and activates kappa opioid receptor for its signaling. Although there are some reports on NEP’s anti-aging and anti-wrinkling effects on skin cells, its action mechanism is not well-known yet in detail. In this study, the effects of NEP on anti-skin aging and autophagy activation in human dermal fibroblast cells (called Hs68) irradiated with UVB (35 mJ/㎠) were investigated. When Hs68 cells were treated with NEP (5 ㎍/㎖) for 15 min, MAP kinase signaling pathway could be activated, as judged by Western blottings using antibodies raised against p-ERK, ERK, p-p38, p38, p-JNK, and JNK. In addition, the expression levels of autophagy-related proteins, including Beclin-1, Atg12 and LC3 I-II were increased in Hs68 cells treated with NEP (5 ㎍/㎖) for 30 min, accompanied with the decreased level of mTOR. The ability of NEP to activate the autophagy system also could be confirmed by the confocal microscopy using an immunostaining with anti-LC3 antibody that NEP (5 ㎍/㎖) could induce the formation of autophagosomes in Hs68 cells irradiated with UVB (35 mJ/㎠). These results suggest that NEP can activate the autophagy system through the activation of MAP kinase signaling pathway in cells irradiated with UVB. In addition, NEP could decrease the expressions of skin aging-related proteins, such as ERK, p38, and JNK, suggesting that it can exert anti-aging effects against photo-aging in skin. NEP (5 ㎍/㎖) also could inhibit the production of reactive oxygen species (ROS) in the Hs68 cells irradiated with UVB (35 mJ/㎠), as judged by measuring the intensity of the fluorescence emitted from 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA). These results suggest that NEP can show the anti-aging effects on UV-irradiated skin through the decreases of the expression/production levels of aging-related proteins and ROS. On the other hands, The results of RT-PCRs showed that the transcription level of type I procollagen gene could be increased to approximately 10%, whereas that of matrix metalloproteinase (MMP)-1 gene could be decreased to about 46% by the treatments with NEP (5 ㎍/㎖) for 24 h in Hs68 cells irradiated with UVB (35 mJ/㎠) in a dose-dependent manner. In fact, the relative synthesis of collagen increased to an average of 32.4% by the NEP treatment through its inhibitory effects on collagenase activity in UVB-irradiated Hs68 cells. All these results suggest that NEP may reduce the formation of ROS by activating the autophagy system and also prevent from UVB-induced extracellular matrix degradation by inhibiting the expression of MMP-1 through the inhibition of MAP kinase signaling pathway. Taken together, all the results obtained by this study demonstrate that NEP can be a potential anti-skin photoaging agent.|피부노화(skin aging)란 피부의 구조적 및 기능적 특성이 노화가 진행됨에 따라 퇴행하는 현상을 말한다. 특히 자외선(UV-light)에 의한 광노화(photoaging)는 피부노화에 가장 심대한 영향을 미치는 요인 중 하나이다. 자외선은 막 단백질의 분해, 산화적 스트레스 및 염증 반응 등을 유발하기 때문이다. 세포에서 기능을 다한 세포소기관들 또는 단백질들을 제거하는 과정인 autophagy(자가소화작용 또는 자식작용이라고도 함)는 세포의 노화 및 분화과정에서도 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한 최근에는 항노화 및 수명연장에도 중요한 역할을 할 것으로 예측되고 있다. 알파-네오엔돌핀(α-neoendorphin, NEP)은 neuropeptides의 일종으로 10개의 아미노산(H2N-YGGFLRK- YPK-COOH)으로 이루어져 있으며, kappa opioid receptor를 활성화시켜 세포 내로 신호를 전달한다. NEP는 또한 항노화(anti-aging) 및 항주름(anti-wrinkling)에 효과가 있는 것으로 알려져 있지만 그 작용기작에 대해서는 아직 알려진 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 자외선 B(ultraviolet B, UVB)를 조사한 사람의 피부 섬유아세포(Hs68)에서 NEP에 의한 autophagy 활성화 및 항노화 기작을 분석하였다. Western blotting으로 분석한 결과, NEP(5 ㎍/㎖)를 15분간 처리한 Hs68 세포에서 ERK, p38 및 JNK 단백질의 발현양은 모두 증가하는 반면, autophagy의 음성조절자로 알려진 mTOR의 발현양은 감소함을 확인하였다. 또한, Beclin-1, Atg12와 LC3 등과 같은 autophagy-연관 단백질들의 발현도 NEP(5 ㎍/㎖)를 30분간 처리하였을 때 증가함을 확인하였다. 이러한 NEP의 autophagy 활성화능은 autophagosome들을 confocal 현미경으로 관찰함으로써 재확인할 수 있었다. UVB(35 mJ/㎠)를 조사하고 NEP(5 ㎍/㎖)를 30분간 처리한 Hs68 세포들은 실제로 autophagosome들을 갖고 있었다. 한편, NEP는 UVB에 의해 증가된 활성산소(reactive oxygen species, ROS) 생성을 감소시킨다는 사실을 UVB(35 mJ/㎠)를 조사하고 NEP(5 ㎍/㎖)를 처리한 Hs68 세포에서 2′,7′-dichlorofluorescin diacetate(DCFH-DA)로부터 발생하는 형광강도를 측정함으로써 확인하였다. 또한 Hs68 세포에 24시간 동안 NEP(5 ㎍/㎖)를 전처리(pre-treatment)한 후, UVB(35 mJ/㎠)를 조사하고, 동량의 NEP를 24시간 처리한 다음, Western blotting으로 pro-aging factor들(ERK, p38, 및 JNK 등)의 발현량을 분석한 결과, 이들 모두의 발현이 NEP에 의해 평균 6.9% 감소됨을 확인하였다. 또한 동일한 실험조건 하에서 MMP-1 유전자의 전사율은 약 46% 감소되었고, procollagen type I의 전사율은 약 10% 증가됨을 RT-PCR을 통해 확인하였다. Collagenase의 합성기질(synthetic substrate; 4-phenylazobenzyloxy- carbonyl-Pro-Leu-Gly-Pro-Arg trifluoroacetic acid)을 이용하여 NEP를 처리한 세포에서 collagenase 활성을 측정한 결과, collagenase 활성이 평균 35.1% 감소됨을 확인하였으며, ELISA를 이용하여 procollagen의 생성량을 측정한 결과, 평균 32.4%가 증가되었음을 확인하였다. 이러한 결과를 종합하여 볼 때, NEP는 피부세포의 autophagy 시스템을 활성화시키고, 세포 내 유해산소 ROS를 줄이며, MMP-1의 발현 및 활성 억제를 통해 procollagen 생성량을 증가시킴으로서 UVB에 의한 광노화를 억제하는 것으로 판단된다. 따라서, NEP은 피부세포의 항상성에 중요한 역할을 하는 autophagy를 활성화시켜 항노화 및 주름개선에 효과적인 약물일 가능성을 시사한다.