Regulation of Cellular Developmental Process by a Calcium Binding Protein CBP7 in Dictyostelium

Abstract

Calcium ions play an important role in development and intracellular signaling. Fourteen different genes encoding small calcium-binding proteins (CBPs) have been identified in Dictyostelium. However, most of CBPs in the developmental process have not been studied yet. In this study, I investigated functions of CBP7, one of the 14 CBPs, in morphogenesis, adhesion, growth, and development by analyzing phenotypes of the cells expressing the CBP7 RNA interference constructs (CBP7-RNAi), the full-length wild-type CBP, or point-mutated CBP7 proteins. CBP7 is composed of 169 amino acids and contains four EF-hand domains. CBP7 showed significant sequence homology to CBP3, CBP6, and CBP12, which are involved in cell aggregation and adhesion. CBP7-overexpressing cells showed increased cell size and strong adhesion compared with wild-type cells. In contrast, the growth rate of CBP7-overexpressing cells was lower than that of the wild-type cells. The CBP7-overexpressing cells showed complete loss of developmental process. These cells remained at the single-cell growth stage under development-inducing conditions, while wild-type cells formed aggregations within 6–8 h of development and eventually formed fruiting bodies. In addition, CBP7-overexpressing cells exhibited defects in chemotaxis and low level of cytosolic free calcium concentration. The experiments using point-mutated CBP7 proteins showed that all EF-hand domains of CBP7 were important for CBP7 to function in the developmental process. Yeast two-hybrid experiments using CBP7 as a bait showed that CBP7 specifically binds to RasG. These results suggest that CBP7 has important roles in the development process through all of its EF-hand domains and by binding to RasG. The present study would contribute to further understand the mechanism by which calcium regulates development and the relationship between the calcium signaling and Ras signaling pathways.|칼슘 이온은 발달 및 세포 내 신호 전달에 중요한 역할을 한다. Dictyostelium 에서는 칼슘 결합 단백질 (CBPs)을 코딩 하는 14 가지 유전자가 있지만, 대부분의 CBP는 발생 과정에서 어떤 기능을 하는지 아직 연구되지 않았다. 본 연구에서는, CBP7의 RNA 간섭 세포주, CBP7 과발현 세포주, EF-hand 도메인의 점 돌연변이 세포주 및 절편 단백질 발현 세포주를 이용하여 세포의 형태형성, 부착, 성장, 발생에서 14개의 CBP 중 하나인 CBP7의 특이적인 기능들이 무엇인지를 밝히고자 하였다. CBP7은 169 개의 아미노산으로 구성되어 있으며 4 개의 EF-hand 도메인을 포함하고 있다. CBP7은 세포 응집에 관여하는 CBP3, CBP6 및 CBP12와 유의한 서열 상 동성을 보였다. CBP7 과발현 세포는 야생형 세포에 비해 세포 크기가 증가하고 강한 부착을 보였다. 반면, CBP7 과발현 세포의 성장 속도는 야생형 세포의 성장 속도보다 낮았다. CBP7 과발현 세포는 발생 과정이 전혀 일어나지 않았다. 이 세포들은 발달 유도 조건 하에서 단일 세포 성장 단계에 머물러 있는 반면, 야생형 세포는 6-8 시간 내에 발달을 시작하여 과실체를 형성하였다. 또한, CBP7 과발현 세포는 주화성 세포이동에서 결함을 보였으며 낮은 수준의 세포질 내 자유 칼슘 농도가 야생종에 비해 낮았다. 점 돌연변이를 시킨 CBP7단백질을 이용한 실험결과, CBP7의 모든 EF-hand domain이 CBP7이 발달 과정에서 기능하는 데 중요하다는 것을 보여 주었다. CBP7을 미끼로 사용하는 yeast two-hybrid 실험결과 CBP7이 RasG와 특이적으로 결합한다는 것을 보여 주었다. 이러한 결과는 CBP7이 모든 EF-hand 도메인을 통한 발달 과정과 RasG에 결합 함으로써 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 칼슘에 의한 발생과정 조절 기전과 칼슘/라스 신호전달경로의 연관성을 이해하는데 기여할 것이다.