Proteasome inhibitor, bortezomib 유도 세포사 기전 연구

Abstract

Bortezomib은 대부분의 세포에서 apoptosis를 유도하는 것으로 잘 알려진 proteasome inhibitor 이다. Bortezomib에 의한 세포사는 세포 내의 생존신호와 죽음신호에 의해 조절된다고 알려져 있지만, 대부분의 민감성 세포들에서 bortezomib에 의한 세포사 과정은 매우 빠르게 진행되어 세포 내 생존신호가 죽음신호로 전환되는 과정에 대해서는 밝혀진 바 없다. 본 연구는 bortezomib에 의한 세포사에 대하여 중간 정도의 저항성을 나타내는 CT26와 B16F10 세포주를 이용하여 bortezomib에 의한 세포 내 신호 전환을 알아 본 연구 이다. Bortezomib에 의한 세포사에 민감한 BMK 세포주는 10 nM 혹은 50 nM의 bortezomib 존재 시, 24 시간 내에 50% 이상의 세포들이 죽지만, CT26와 B16F10 세포주는 100 nM의 bortezomib을 처리하더라도 24 시간 내에 20% 이하의 세포들 만 죽는 것으로 확인되었다. 하지만, 48 시간이 지나면 거의 모든 세포들이 죽게 되는 것으로 보아 24 시간 내에는 세포의 생존신호가 작동하는 것으로 여겨졌다. proteasome inhibition 후 작동하는 것으로 알려진 endoplasmic reticulum (ER) stress 반응과 autophagy가 CT26와 B16F10 세포주에서도 활성화됨을 immunoblotting analysis를 통해 확인하였다. ER stress 반응과 autophagy가 생존신호로 역할을 하는지 확인하기 위하여 ER stress response 억제제인 4μ8C (IRE-1 inhibitor), GSK2606414 (PERK inhibitor) 또는 Salubrinal (eIF2α inhibitor)와 autophagy 억제제인 bafilomycin A1 (BfA) 또는 3-methyl adenine (3-MA)를 각각 bortezomib과 함께 처리한 후 세포사를 확인한 결과 세포사가 증가함을 확인하였다. 대표적인 죽음신호인 caspases는 12 시간 이후부터 활성화하기 시작하여 24 시간이 지나면 최고조에 달하는 것으로 보인다. Caspase 억제제에 의한 세포사 억제를 확인하였지만 세포사는 완벽히 억제되지 않았으며, 또 다른 죽음신호인 활성산소종의 증가를 확인한 결과 8시간 이후부터 증가하는 것을 확인했다. 활성산소종을 감소시키는 NAC과 caspase 억제제를 동시에 처리하였을 경우 세포사는 더 많이 감소하는 것을 확인하였다. 또한 NAC에 의해 활성산소종이 감소하면 caspase의 활성 또한 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 결과들을 종합하여, bortezomib 처리 후 세포의 생존신호와 죽음신호의 변화를 시간 별로 확인해볼 수 있었다. CT26 세포주에서는 생존신호가 죽음신호로 변환되는 conversion model이, 그리고 B16F10 세포주에서는 생존신호가 죽음신호와 경쟁하다가 죽음신호로 변환되는 competition model과 부합하는 것을 확인하였다.