G9a inhibition by BIX01294 ameliorates neuronal differentiation and degeneration

Abstract

Recent studies have shown that epigenomic modifications are significantly associated with neuronal differentiation. Many neuronal specific genes contain the repressor element-1 (RE-1), which recruits epigenetic modulators such as the histone methyltransferase G9a and interrupts the expression of neuronal genes in non-neuronal cells. This study investigated the functional role of G9a during neuronal differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells (BM-MSCs). Human BM-MSCs treated with BIX01294 as G9a inhibitor showed an increased expression of various neuronal-lineage genes. Using genomic sequence analysis, I identified RE-1 consensus sequences in the proximal region of several neuronal specific genes. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assay results have showed that H3K9me2 (dimethylation of lysine 9 on histone 3) occupancy at RE-1 containing sequences from neuronal specific genes was significantly decreased in BIX01294-MSCs. When BIX01294-MSCs were differentiated with neuronal induction medium, cells differentiated more effectively into neuron-like cells complete with a cell body and dendrites. Expression of neuronal specific genes containing the RE-1 sequences was significantly increased in differentiated BIX01294-MSCs, as confirmed by immunocytochemical staining and immunoblotting. Thus, this study shows that BIX01294-pretreated human BM-MSCs can be effectively differentiated into neuron-like cells by induced expression of neuronal specific genes containing RE-1 sequences. I have further investigated the correlation between protective effect and expression of RE-1 containing neuronal specific genes in G9a inhibited neuronal cells. I have identified the H3K9me2 is increased in hydrogen peroxide (H2O2) treated SH-SY5Y cells and that decreased by G9a inhibition. Therefore, I suggest that G9a inhibition was may contribute in treatment of neurodegenerative disorders by oxidative stresses.| 현재 연구들은 후생 유전적 변형이 신경분화에 크게 관여한다고 보고된다. 많은 신경특이 유전자들은 repressor element-1 (RE-1)을 포함하고 있고, 이곳에 히스톤 메틸화 효소 G9a와 같은 후생 유전적 조절자들이 결합하여 비 신경세포에서 신경 유전자의 발현을 억제한다. 본 연구에서는 인간 골수 중간엽 줄기세포(BM-MSCs)의 신경분화 동안 G9a의 기능적인 역할을 조사하였다. G9a 억제제 BIX01294가 처리된 인간 골수 중간엽 줄기세포는 다양한 신경계통 유전자의 발현이 증가하는 것이 관찰된다. 본 연구에서 유전자 서열분석을 이용하여 다양한 신경 특이 유전자에서 RE-1 공통서열을 확인하였다. Chromatin immunoprecipitation (ChIP)를 이용하여 신경 특이 유전자의 RE-1을 포함하는 서열에서 H3K9me2의 정도를 확인해본 결과 BIX01294가 처리된 중간엽 줄기세포에서 H3K9me2이 크게 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었다. 신경세포 분화 유도 배지에서 BIX01294가 전 처리된 세포가 BIX01294가 전 처리되지 않은 세포보다 신경세포로의 분화가 좀 더 잘 이루어지는 것을 확인하였다. Immunocytochemistry staining 과 immunoblotting을 이용한 RE-1을 포함하는 신경 특이 유전자의 발현분석에서 BIX01294 전 처리 후 분화를 유도한 중간엽 줄기세포가 BIX01294 전 처리 없이 분화를 유도한 중간엽 줄기세포에 비해 RE-1을 포함하는 신경 특이 유전자의 발현이 크게 증가하여 있는 것을 확인하였다. 따라서, 본 연구는 BIX01294가 전 처리된 인간 골수 중간엽 줄기세포가 RE-1을 포함하는 신경 특이 유전자의 발현 유도에 의해 신경세포로의 분화가 촉진되었음을 제시한다. 더 나아가 G9a가 억제된 신경 세포에서 RE-1을 포함하는 신경특이 유전자들의 발현과 보호효과 사이에 연관성을 조사했다. 이 연구에서 과산화수소가 처리된 SH-SY5Y 세포에서 H3K9me2가 증가하는 것을 확인했고 이것은 G9a 억제에 의해 감소된다. 그러므로, G9a 억제는 신경세포에서 산화스트레스에 의해 유도되는 신경세포 손상에서 세포 보호 효과가 있을 것이라고 제안한다.