Effects of tranexamic acid on the activation of autophagy system and the production of melanin in cultured melanoma cells

Abstract

Skin color is determined in accordance with the concentration and the distribution of melanin pigments in the skin interior, which are influenced by genetic factors and physiological or environmental conditions, such as ultra-violet (UV) light, fatigue and stress. The main skin color pigment, melanin is produced by the oxidation of the amino acid tyrosine in melanocytes. On the other hands, it is been well known that the cellular autophagy system plays an important role in removing wastable proteins (misfolded of aggregated) and eliminating dysfunctional organelles, including mitochondria, endoplasmic reticulum and peroxisomes. Recent studies show that the system also can be involved in the biogenesis of melanin and the degradation of melanosome, suggesting that the it's activation can be related to the fate of skin color by reducing the production of melanin pigments. However, there are still no direct evidences, showing a relationship between the activation of autophagy system and melanogenesis. The compound tranexamic acid (trans-4-aminomethylcyclohexanecarboxylic acid, TXA) routinely used by this study has been used as a hemostatic agent, due to its selective anti-plasmin effect. In recent, TAX is also being used as an agent to reduce the synthesis of melanin in melasma, although its action mechanism is not well known. Therefore, the present study was performed to examine the effects of TXA on the activation of autophagy system and the production of melanin in a cultured melanoma cell line called B16-F1. The results obtained were as follows: The result of mushroom tyrosinase assay showed that TXA could directly inhibit the mushroom tyrosinase activity in vitro when L-tyrosine or L-DOPA (L-3,4-dihydroxyphenylalanine) was used as substrate. In addition, the rate of melanin synthesis could be decreased to approximately 46% by the treatment with TXA (4 ㎎/㎖) for 52 h in B16-F1 cells that were stimulated by α-MSH (α-melanocyte-stimulating hormone) to synthesize melanin. These results suggest that TXA can modulate the production of melanin by inhibiting tyrosinase. On the other hands, TXA could mediate the production of autophagy-related proteins, such as MAPKs (ERK and p38 etc), Beclin-1, Atg12, and LC3 I-II, whereas it could decrease the synthesis of mTOR complex, as judged by Western blottings. In addition, the confocal microscopic analysis clearly showed that TXA could lead the formation of autophagosomes in B16-F1 cells, as shown by an immunostaining with anti-LC3 antibody. To examine the effects of TXA on ERK1/2 signaling pathway and the production of melanogenesis-associated proteins, the expression levels of MAPKs (ERK and p38 etc), MITF (microphthalmia-associated transcription factor), tyrosinase, and TRP1 were also measured by Western blottings. The results showed that the compound clearly decreased the expression levels of MITF, tyrosinase, and TRP1/2 (tyrosinase-related protein 1 and 2), suggesting that it could decrease the production of melanin synthesis through by alleviating the production levels of tyrosinase and TRP1/2, which are all involved in the melanin synthesis, due to the reduced-MITF protein level. The involvement of autophagy activation by TXA in melanin synthesis also could be confirmed in B16-F1 cells transfected with 60 pmols of small interfering RNAs (siRNAs) for mTOR and Atg5. When the non-transfected cells were treated with TXA (0.1, 0.5, 1, 2, or 4 ㎎/㎖) for 52 h, there were clear decreases in melanin synthesis in a dose-dependent manner. However, when the cells that were transfected with siRNAs for mTOR or Atg5 were treated with 1 ㎎/㎖ of TXA for 52 h, the levels of melanin synthesis could be increased to approximately 20% and 40%, respectively, compared to that in non-transfected cells. In conclusion, all results obtained by this study suggest that TXA can inhibit tyrosinase activity directly and also reduce the melanin synthesis in skin by activating the ERK signaling pathway and the autophagy system. Therefore, the results demonstrate that TXA could be a potential agents for melasma treatment and also for a cosmetic compound for skin whitening. |피부색깔을 결정하는 멜라닌(melanin) 색소의 생성은 유전적 요인, 환경적 요인(자외선 등) 및 생리적 조건(피로 및 스트레스 등)에 의해 영향을 받는다. 멜라노사이트(melanocyte)에서 생성되는 흑갈색 색소인 멜라닌은 타이로시나아제(tyrosinase)에 의해 아미노산인 타이로신(tyrosine)이 차례로 L-3,4-dihydroxyphenylalanine(L-DOPA)과 도파퀴논(dopaquinone)으로 전환 되는 산화반응을 통해 생성된다. 최근의 연구결과들은 멜라닌의 분해 및 생합성이 autophagy system에 의해 영향을 받을 수 있음을 보여주고 있으나, 이에 대한 자세한 기작연구는 매우 미흡한 실정이다. 한편, 지혈제로 사용되는 트라넥사민산(tranexamic acid; trans-4-aminomethylcyclohexanecarboxylic acid, TXA)은 케라티노사이트(keratinocyte)에서 melanocyte로의 플라스민(plasmin)에 의한 멜라닌 생성을 억제하는 효능이 있는 것으로 알려지면서 최근에는 기미 치료제로도 사용되고 있다. 그러나 이는 TXA가 멜라닌 확산을 일시적으로 차단한다는 연구결과에 근거 한 것이며, 멜라닌 생성에 미치는 TXA의 작용기작은 알려진 바가 없다. 따라서 본 연구에서는 TXA에 의한 autophagy 활성화 및 멜라닌 합성 억제기작 연구를 통해 TXA의 미백 효능 여부를 분석하고자 하였다. L-tyrosine과 L-DOPA를 기질로 버섯 tyrosinase 활성에 미치는 TXA의 영향을 분석한 결과, TXA는 tyrosinase 활성을 직접적으로 억제시킬 수 있음을 확인하였다. 또한 α-MSH(α-melanocyte-stimulating hormone) (10 nM)를 처리하여 멜라닌 생성을 촉진 시킨 흑색종 세포주(B16-F1)에 TXA(4 ㎎/㎖)를 52시간 동안 처리할 경우, 멜라닌 생성률이 약 46% 저해됨을 확인하였다. 이러한 결과는 TXA가 tyrosinase 활성을 직접 억제할 수 있을 뿐 아니라 세포에서도 tyrosinase 활성을 억제함으로써 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 보여주는 것이다. 본 연구에서는 또한 autophagy 활성화에 미치는 TXA의 영향을 규명하기 위하여 B16-F1 세포에 TXA(1 ㎎/㎖)를 15분 동안 처리한 후, autophagy 유도 단백질들의 발현량을 Western blotting으로 분석하였다. 그 결과, MAPK(ERK 및 p38 등), Beclin-1, Atg12 그리고 LC3의 단백질 발현량은 증가되었으나, autophagy의 음성조절자(negative regulator)로 알려진 mTOR의 단백질 발현량은 감소됨을 확인하였다. 이러한 결과는 TXA는 MAPK들을 활성화 시키는 반면, mTOR의 발현은 감소시킴으로써 autophagy system을 활성화시킬 수 있음을 시사하는 것이다. 이러한 TXA의 autophagy 활성화 특성은 항-LC3 항체로 immunostaining한 세포의 confocal 현미경 관찰로도 재확인하였다. 실제로 B16-F1 세포에 TXA를 처리하면 autophagosme들이 관찰되었다. 본 연구에서는 또한, TXA를 처리한 B16-F1 세포의 멜라닌 생성양상을 항-MAPK, -MITF, -tyrosinase 및 -TRP1 항체를 사용한 Western blotting으로 분석하였다. 그 결과, MITF, tyrosinase 및 TRP1의 발현량이 모두 감소됨을 확인하였다. 이러한 결과는 TXA에 의해 MITF 단백질 발현량이 감소됨으로써 멜라닌 합성에 관여하는 tyrosinase와 TRP1의 단백질 발현량이 감소되었음을 시사하는 것이다. 또한 멜라닌 생성에 미치는 autophagy 활성화의 영향을 분석하기 위해 mTOR 및 Atg5에 대한 small interfering RNAs(siRNA)를 B16-F1 세포에 transfection한 후 멜라닌 생성을 분석하였다. 해당 siRNA들에 의해 mTOR와 Atg5의 발현이 억제된 B16-F1 세포에 TXA(0.1, 0.5, 1, 2, or 4 ㎎/㎖)를 52시간 동안 처리한후 멜라닌 생성량을 측정한 결과, 멜라닌 생성량이 각각 20% 및 40% 정도 증가되었음을 확인하였다. 이러한 결과는 TXA는 autophagy system을 활성화시킴으로써 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 제시하는 것이다. 이상의 결과들은 TXA가 tyrosinase를 직접적으로 저해시킬 수 있을 뿐만 아니라 ERK 세포신호 전달계를 통해 autophagy 활성화를 유도하며, MITF 인산화를 통해 단백질 분해를 촉진시켜 멜라닌 합성에 관여하는 단백질의 발현량을 감소시킬 수 있음을 시사하는 것이다. 결론적으로, 본 연구결과들은 TXA가 피부세포의 항상성에 중요한 역할을 하는 autophagy의 활성화를 제어할 수 있는 항노화 및 미백 치료제로 사용될 가능성을 보여주고 있다.