Characterization of Rap1GAPs and a Rap1 Downstream Effector FrmB in Dictyostelium

Abstract

Cell movement involves the coordinated regulation of the cytoskeleton, F-actin-mediated protrusions at the front of the cell and myosin-mediated contraction of the posterior. The small GTPase Rap1 functions as a key regulator in the spatial and temporal control of cytoskeleton reorganization for cell migration. This study focuses on the mechanism for establishment of cell polarity by differential localizations of the cytoskeleton and spatial and temporal regulation of cytoskeleton reorganization via the Rap1 signaling pathway during chemotaxis. Cell migration requires a defined cell polarity, which is formed by diverse cytoskeletal components differentially localized to the poles of the cell. This study investigated Rap1-specific GTPase activating proteins and downstream effectors of Rap1. RapGAP3 transiently and rapidly translocates to the cell cortex in response to chemoattractant stimulation and localizes to the leading edge of migrating cells. Part I of the present study examined the localization of truncated RapGAP3 proteins and found that the I/LWEQ domain in the central region of RapGAP3 was sufficient for posterior localization in migrating cells, as opposed to the leading-edge localization of full-length RapGAP3. All truncated proteins accumulated at the leading edge of migrating cells exhibited clear translocation to the cell cortex in response to stimulation, whereas proteins localized to the posterior in migrating cells displayed no translocation to the cortex. The I/LWEQ domain appears to passively accumulate at the posterior region in migrating cells due to exclusion from the extended front region in response to chemoattractant stimulation rather than actively being localized to the back of cells. The results suggest that posterior localization of the I/LWEQ domain of RapGAP3 is likely related to F-actin. At the lateral and posterior regions of the cell there might be another type of F-actin with different properties compared to newly formed F-actin at the leading edge of migrating cells. In addition to RapGAP3, in the previous studies on Rap1-specific GAP proteins, RapGAP1, RapGAPB, and RapGAP9 were identified and characterized. RapGAP1 was found to control the adhesion of cells at the leading edge of the cell during chemotaxis, while RapGAP3 was found to play an important role in the cell’s developmental process. RapGAP9 was found to be associated with cell morphogenesis, adhesion, and cytokinesis. In Part II, I studied RapGAP6, one of the putative Rap GAP proteins expected to function as a Rap1 GAP protein. rapGAP6 knockout cells and overexpressing cells were confirmed by PCR and Western blot analysis. RapGAP6, which is localized to the cytosolic vesicles, was found to be involved in cell-substratum adhesion and chemotaxis but not in development. Phg1, Phg2, MyosinVII, and Talin were found to be Rap1 downstream effectors that all play similar roles in cellular adhesion. Part III of this study was focused on the Rap1 downstream effectors containing the RA domain. Phg2 and FERM-domain containing proteins are considered as Rap1 downstream effectors proteins since these proteins have a RA domain. Six proteins have been identified to have FERM domains in Dictyostelium : TalinA, TalinB, MyosinVII, FrmA, FrmB and FrmC. In the present work, to study the functions of FrmB, a Rap1 downstream effector, FrmB knockout cells and overexpressing cells were created. FrmB was shown to be involved in cell adhesion, migration, and development. The results of this study would contribute to understand the Rap1 signaling pathway and several biological processes including cell migration and development.|세포이동은 세포 앞쪽 부분의 F-actin 매개성 돌출과 뒤쪽의 myosin 매개성 수축하는 세포골격 조절을 통해 일어난다. Small GTPase Rap1은 세포골격을 시간적, 공간적으로 재배열하여 세포이동 조절에 중요한 역할을 한다. 본 연구에서는 세포골격의 재배열에 의한 세포 극성화와 주화성 이동 시 Rap1 신호전달경로를 통한 세포골격의 시공간적 재배열에 대해 연구하였다. 세포이동은 다양한 세포골격 구성요소들이 세포의 서로 다른 극에 위치하게 되는 세포 극성화가 필요하다. 본 연구에서는 Rap1에 특이적인 비활성 단백질과 하위 작동 단백질에 대해 연구하였다. RapGAP3는 주화성자극에 반응하여 빠르고 일시적으로 세포 피질로 위치이동하고 이동하는 세포의 앞쪽에 위치한다. Part I 에서는 RapGAP3 단백질 절편들의 위치를 확인하였다. RapGAP3의 전체 길이는 이동하는 세포의 앞쪽에 위치하지만, RapGAP3의 중앙에 위치한 I/LWEQ 도메인은 뒤쪽에 위치하는 것을 발견하였다. 이동하는 세포의 앞쪽에 축적되는 대부분의 단백질 절편들은 자극에 반응하여 세포 피질로 위치 이동한 반면, 뒤쪽에 위치하는 단백질들은 이러한 변화를 관찰할 수 없었다. 주화성자극에 대한 반응으로 I/LWEQ 도메인은 능동적으로 세포 뒤쪽에 위치하는 것과는 다르게, 뻗어나가는 앞쪽부분에 축적된 단백질이 사라지면서 이동하는 세포의 뒤쪽에서 수동적으로 축적하였다. RapGAP3의 I/LWEQ 도메인이 세포의 뒤쪽에 위치하는 것은 F-actin과 관련이 있다. 세포의 옆쪽과 뒤쪽 부분은 이동하는 세포의 앞쪽에 새롭게 형성되는 F-actin과는 다른 특성을 가진다. RapGAP3 이외에도, 이전 연구에서 Rap1-특이적 GAP 단백질로 RapGAP1, RapGAPB 및 RapGAP9이 동정되었고 기능이 밝혀져 있다. RapGAP1은 주화성이동을 하는 세포의 앞쪽 가장자리에서 세포의 부착을 조절하는 것으로 알려져 있으며, RapGAP3는 세포의 발달 과정에서 중요한 역할을 한다. RapGAP9은 세포 형태 형성, 부착 및 세포질 분열과 연관되어 있다. Part II 에서는 Rap GAP 단백질들 중 하나인 RapGAP6 에 대해 연구하였으며, Rap1 GAP 단백질로서 기능을 할 것으로 예상된다. rapGAP6 결손 세포주와 과발현 세포주는 PCR 과 웨스턴 블롯을 통해 확인하였다. RapGAP6는 세포질 소포에 위치하고, 세포-바닥간 접착 및 주화성이동에는 관여하지만 발달에는 관여하지 않는 것을 발견하였다. Phg1, Phg2, MyosinVII 및 Talin은 Rap1의 하위 작동 단백질로 모두 세포 부착에 대해서 유사한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 본 연구의 Part III 에서는 RA 도메인을 갖고 있는 Rap1 하위작동 단백질에 대해 연구하였다. Phg2 와 FERM 도메인을 포함하는 단백질들은 RA 도메인을 가지고 있어 Rap1 하위작동 단백질로 간주된다. Dictyostelium 에는 TalinA, TalinB, MyosinVII, FrmA, FrmB 및 FrmC를 포함한 6 개의 단백질이 FERM 도메인을 가지는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서는 Rap1 하위작동 단백질인 FrmB를 연구 하기 위해, frmB의 결손 세포주와 과발현 세포주를 만들었다. FrmB는 세포 부착, 이동 및 발달에 관여하였다. 본 연구 결과는 Rap1 신호 전달 경로와 세포이동과 발달에 대한 생물학적 과정을 이해하는데 기여할 것으로 기대된다.