Functional Analysis of NEDDylation on the Assembly of Stress Granule

Abstract

Stress granules (SGs) are cytoplasmic RNA – protein (RNP) aggregates formed in response to stress exposure. SGs usually harbor translationally stalled mRNPs, RNA binding proteins, signaling molecules and play important roles in regulating gene expression and cell fate. Formation of these cytoplasmic compartments has been linked to several pathological conditions including frontotemporal dementia (FTD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and cancer, whereas the cellular signaling pathways that lead to SG assembly are incompletely understood. Here we show that neddylation promotes SG assembly in response to arsenite-induced oxidative stress. Inhibition or depletion of key components of the neddylation machinery concomitantly inhibits stress-induced polysome disassembly and SG assembly. Affinity purification and subsequent mass-spectrometric analysis of Nedd8-conjugated proteins from translationally stalled ribosomal fractions identifies ribosomal proteins, translation factors and RNA-binding proteins (RBPs), including SRSF3, a previously identified SG regulator. We show that SRSF3 is selectively neddylated at Lys 85 in response to arsenite. Cells expressing a non-neddylatable SRSF3 (K85R) mutant inhibit SG assembly, but do not affect arsenite-induced polysome disassembly. Our observations suggest that the neddylation pathway plays an important role in the SG assembly and that the neddylation of SRSF3 is at least one critical event for mRNP remodeling.|스트레스 과립은 외부환경에서 유래된 다양한 스트레스에 의해 형성되는 세포질 내 RNA-protein (RNP) 응집체이다. 스트레스과립은 번역과정이 저해된 mRNP로서, RNA 결합단백질, 신호전달물질을 포함하고 있으며, 유전자 발현을 선택적으로 조절하여 세포의 운명을 결정하는 중요한 역할을 수행하고 있다. 이러한 스트레스 과립이 최근 연구에서 frontotemporal dementia (FTD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS)와 같은 퇴행성 신경질환과 암과 같은 질환과 연관성이 있음이 밝혀졌다. 그럼에도 불구하고 스트레스과립이 어떠한 분자적 기전에 의해서 형성이 되는지는 알려진 바가 거의 없다. 본 연구에서는 arsenite 스트레스에 반응하여 형성되는 스트레스과립이 NEDDylation 신호전달체계에 의해 조절됨을 밝혔다. NEDDylation 신호전달체계에서 필수적인 역할을 하는 유전자들이 결핍되었을 때 폴리좀 (polysome)의 분해가 저해되고, 스트레스과립의 형성이 억제됨을 확인하였다. Affinity 정제법과 질량분석 기법을 이용하여 NEDD8이 결합되는 타겟 프로테인들을 밝혀내었다. 이러한 단백질들 중에는 기존에 알려진 리보솜 단백질과 다양한 종류의 RNA결합 단백질들이 포함되어 있었으며, 무엇보다도 최근 본연구실에서 그 기능이 밝혀진 SRSF3단백질도 포함되어 있음을 확인하였다. 추가적인 분자기전 연구를 통하여 SRSF3 단백질의 리신 85번이 스트레스에 반응하여 NEDDylation됨을 확인 하였고, 이 과정을 통해 스트레스과립의 형성이 유도됨을 확인하였다. 본 연구를 통해 처음으로 NEDDylation 신호전달체계가 SRSF3를 타겟팅함으로서 스트레스 과립의 형성이 유도됨을 증명하였다.