Complementary Functions of Dictyostelium Rap1 Deactivating Proteins in Cell Migration and Development

Abstract

The small GTPase Rap1 is an important regulator in cell adhesion and cell migration. Recently, it has been reported that spatial and temporal regulation of Rap1 activity by Rap1-specific GTPase-Activating Proteins (RapGAPs) is required for development and cell migration in Dictyostelium. RapGAP1, a Rap1-specific GAP protein, is involved in spatiotemporal regulation of cell adhesion at the front of chemotaxing cells. RapGAP3 is associated with morphogenesis and development, and RapGAP9 is involved in cell adhesion and cytokinesis. rapGAP1 knockout cells had a higher cell substratum adhesion than wild-type, and rapGAP3 knockout cells had defects in the late mound stage, delaying fruiting body formation. Cells lacking RapGAP9 showed flatten and spread morphology compared to wild-type cells, and increased cell substratum adhesion. In this study, I investigated overlapping/specific functions of RapGAP1, RapGAP3, and RapGAP9 in morphogenesis, cytokinesis, development, and adhesion by analyzing phenotypes of rapGAPs null cells and rapGAPs null cells expressing each RapGAP or GAP domain. First, I analyzed the morphogenesis and cytokinesis defects of rapGAP9 null cells. The cell size and cytokinesis defects of rapGAP9 null cells were partially complemented by overexpressing RapGAP1 or RapGAP3, suggesting that functions of RapGAP1, RapGAP3, and RapGAP9 are partially overlapped in the processes of morphogenesis and cytokinesis. Next, I examined the complementation of RapGAP proteins in developmental processes. The developmental defects of rapGAP3 null cells were partially complemented by RapGAP9, but not by RapGAP1. The adhesion defects of rapGAP1 null cells were not complemented by overexpressing either RapGAP3 or RapGAP9. On the other hand, interestingly the adhesion defects of rapGAP9 null cells were partially complemented by RapGAP1 or RapGAP3. These results indicate that the functions of RapGAP1, RapGAP3, and RapGAP9 are overlapped and might be redundant in the processes of morphogenesis and cytokinesis. However, in the developmental process, only RapGAP3 and RapGAP9 appear to have overlapped roles while only RapGAP1 and RapGAP9 have partially complementary functions in cell adhesion. The present study investigated the functional interactions among RapGAP proteins, RapGAP1, RapGAP3, and RapGAP9 and determined overlapping/specific functions of RapGAP proteins in several biological processes including morphogenesis, cytokinesis, development, and cell adhesion. These results are expected to contribute for further understanding Rap1 signaling pathway and Rap1-mediated various cellular biological processes.|Small GTPase Rap1은 세포 부착과 세포 이동의 중요한 조절 단백질로 알려져 있다. 최근의 연구에 의하면, Dictyostelium 세포에서 발생 과정과 세포 이동 시, Rap1 비활성화 단백질들 (RapGAPs)에 의한 Rap1 활성의 시간적 공간적 조절이 매우 중요한 것으로 밝혀지고 있다. RapGAP1은 Rap1-특이적 GAP 단백질로써 주화성 이동을 하는 세포의 앞쪽에서 세포의 부착을 조절하는 것으로 알려져 있으며, RapGAP3는 세포의 형태 형성과 발생 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀지고 있다. 최근에 동정된 RapGAP9은 세포 부착과 세포질 분열에 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. Dictyostelium 세포의 성장 단계에서, RapGAP1이 없는 세포는 야생형의 세포에 비해 세포-바닥간의 부착이 증가하며, RapGAP3가 없는 세포는 야생형의 세포에 비하여 late mound stage에 결함이 생겨 과실체의 형성이 지연되며, RapGAP9이 없는 세포는 야생형의 세포에 비해 더 납작해지고 편평해져 세포의 크기가 증가하고 세포-바닥 간의 부착이 증가한다. 또한 세포질 분열에서 RapGAP9이 없는 세포는 야생형의 세포에 비해 다핵을 가지는 세포의 비율이 증가한다. 이를 바탕으로 하여, 본 연구에서는 RapGAP1, RapGAP3, RapGAP9 각각에 대한 knock-out 세포주와 과발현 세포주, 및 절편 단백질 발현 세포주를 이용하여 세포의 형태 형성, 세포질 분열, 발생, 세포 부착에서 각 단백질들의 상호 보완적기능과 특이적 기능들이 무엇인지를 밝히고자 하였다. 세포 형태 형성에서 rapGAP9이 없는 세포에서 세포의 크기가 증가하는 결함은 RapGAPs의 과발현에 의해서 부분적으로 보완되며, 각 RapGAP의 GAP 절편 단백질의 발현에 의해서도 부분적으로 보완되었다. 세포질 분열에서 rapGAP9이 없는 세포에서의 다핵을 가지는 결함이 RapGAP의 발현에 의해서 다핵을 가지는 비율이 감소하였으며 GAP 절편 단백질의 발현에 의해서도 부분적으로 감소하였다. 세포 발생에서, rapGAP3가 없는 세포에서의 발달의 지연이 나타나는 결함은 RapGAP9의 과발현에 의해서 부분적으로 보완되었으나 RapGAP1의 과발현에 의해서는 보완되지 않았다. 또한 RapGAP9의 GAP 절편 단백질의 과발현에 의해서는 부분적으로 보완되었으나 각 RapGAP1, RapGAP3의 GAP 절편 단백질의 과발현에 의해서는 보완되지 않았다. 세포 부착에서 rapGAP1이 없는 세포에서의 세포-바닥 간 부착이 증가하는 결함은 RapGAP3와 RapGAP9의 과발현에 의해서 세포-바닥 간의 부착성이 부분적으로 감소되었으나 보완되지 않았으며 각 RapGAP의 GAP 절편 단백질의 과발현에 의해서도 보완되지 않았다. 또한 rapGAP9이 없는 세포에서의 세포-바닥 간의 부착이 증가하는 결함은 RapGAPs의 과발현에 의해서 부분적으로 보완되며 각 RapGAP의 GAP 절편 단백질의 과발현에 의해서 부분적으로 보완되었다. 이는 세포 형태 형성과 세포질 분열에서 RapGAP 단백질 간의 기능이 공유되며 서로 보완이 가능하고 발생 과정에서는 RapGAP3와 RapGAP9의 기능이 서로 부분적으로 공유되며, 세포 부착에서는 RapGAP1과 RapGAP9의 기능이 부분적으로 공유된다는 것을 나타내 주는 결과이다. 본 연구에서는 Rap1-특이 비활성 단백질들 간의 기능적 상호보완성과 고유성에 대한 연구를 하였으며, 본 연구 결과는 Rap1 신호 전달 경로에 의해 매개되는 다양한 세포 생명 현상을 이해하는데 크게 기여할 것으로 기대된다.