Synthesis and physicochemical characteristics of hydroxyapatite-derived from abalone shell

Abstract

국문초록

전복 패각 유래한 수산화 인회석의 합성과 물리 화학적 특성

강경록

지도교수 : 김수관

조선대학교 치의생명공학과 석사과정

본 연구에서는 전복 패각으로부터 수산화인회석을 합성하여 이에 대한 물리 화학적 특성과 생물학적 안정성 평가를 통하여 향후 치과 의료용 합성골 이식재 재료를 개발하는 효용성 분석을 목적으로 한다. 이에 따라 전복 패각으로부터 합성된 수산화인회석의 분석을 위하여 한국 식품 의약품 안전처 (Ministry of Food and Drug Safety, MFDS)와 한국 식품의약품 안전평가원 (National Institute of food and Drug Safety Evaluation, NiFDS)에서 제공한 의료기기 평가가이드라인에 의거하여 생물학적, 물리ㆍ화학적 특성을 분석하였다. 본 연구를 위하여 완도에서 수집한 전복 패각의 오염물을 제거하기 위하여 1차 증류수 속에 넣고, 초음파세척기(JAC-4020, KODO, Seoul, Republic of Korea)에서 60 분간 초음파 세척을 실시하였다. 1차 세척된 전복 패각을 과산화수소 용액 하에서 90 분간 초음파 세척 실시 후, 잔여 과산화수소를 세척하기 위하여 60 분간 1 차 증류수로 초음파 세척을 실시 한 후 48시간 동안 완전 건조하여 사용하였다. 산화칼슘 합성을 위하여 전복 패각을 전기로(MF-22G, JEIO TECH, Seoul, Republic of Korea)에 넣고 1시간 당 100℃ 승온하여, 950℃에서 3 시간 소결을 실시하였다. 소결 되어 합성된 산화칼슘은 53㎛이하의 분말만을 체 거름하여 실험에 사용하였다. 생성된 전복 패각 유래 산화칼슘을 1 차 증류수에 넣고 0.3 M의 인산을 이용하여 인산화를 진행하였다. 인산화 과정 후 생성된 슬러리는 화학 잔기를 제거하기 위하여 수차례 3차 증류수를 이용하여 여과한 뒤 50℃에서 24 시간 완전 건조하였다. 건조된 슬러리는 전기로에서 시간당 100℃ 승온하여 1230℃에서 3 시간 소결하여 수산화인회석을 합성하였다. 전복 패각 유래 수산화인회석은 주사전자현미경(SEM, JSM 840-A, JEOL co., Japan) 으로 합성 후 표면 분석을 실시하였으며, 에너지 분광분석기 (Energy-Dispersive Spectroscopy, EDS, XS-169, Japan)을 사용하여 Ca/P 비율을 측정하였다. 또한 X-선 회절 분석기 (X-Ray Diffraction, XRD. X’pert PRO MRD, PAN alytical co. The Netherlands)를 통하여, 구조 결정성을 분석 하였으며, 적외선 분광 분석기(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR; Nicolet 6700, Thermo Electron, USA) 분석을 통하여 화학적 특성을 평가하였다. 세포 배양은 Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM, Life Technologies, GRAND Island, NY, USA)배지에 growth factor를 제공하는 10% (w/v) Fetal Bovine Serum (FBS, Life Technologies, Grand Island, USA)을 혼합하여 5% CO2가 공급되는 37℃ CO2 incubator에서 48 시간 배양하여 사용하였다. 세포독성 평가를 위하여 MTT assay cell live & Dead assay를 수행 하였으며, 조골세포 분화능 평가를 위하여 Alkaline phosphatase (ALP) assay와 Alizarine Red S (Sigma–Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) staining을 수행하였다. 전복 패각 유래 수산화인회석은 주사전자현미경 관찰시, 판상형의 형태를 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. EDS 분석을 통한 원소 분석 결과, 소량의 Na 이온이 첨가 되어 있는 것을 제외한 모든 성분이 시판되고 있는 수산화인회석과 거의 동일하였으며 시료 내의 Ca/P 비율 동안 거의 동일함을 확인 할 수 있었다. X-선 회절 분석기를 통한 X선 결정성 분석 평가 결과 시판되고 있는 수산화인회석과의 결정성이 동일함을 확인 하였다. 또한 화학 작용기 확인을 위해 실시한 적외선 분광 분석기 분석 결과 대조군과 동일한 화학 작용기를 확인 할 수 있었다. 체내 독성 평가를 위하여 실시한 MTT 및 Cell live & Dead assay 분석 결과 전복 패각 유래 수산화인회석은 시판되고 있는 수산화인회석에 비해 높은 세포 생존률을 가지며, 대조군과 비교 하였을 때에도 높은 세포 생존률을 확인 할 수 있었다. 전복 패각 유래 수산화 인회석에 의한 골형성능을 분석하기 위하여 인간유래 조골세포인 MG-63 세포에 14 일간 처리 후 ALP assay를 수행한 결과 시판되고 있는 수산화인회석 및 대조군 수준의 골형성능을 확인하였으며, Alizarine Red S Staining을 통하여 고모세포의 무기질화 (Mineralization)를 확인 하였을 때 시판되고 있는 수산화 인회석 수준과 동일함을 확인할 수 있었다. 전복 패각 유래 수산화인회석은 비교 대상인 시판되고 있는 수산화인회석과 물리적, 화학적 특성이 매우 유사하며, 세포 독성 평가에서도 높은 세포 생존률을 확인 할 수 있음에 따라, 향후 치과 의료용 합성골 이식재 개발에서도 우수한 생체 적합성을 가진 생체 재료로서 사용 가능할 것으로 사료된다.