HPLC-ICP-MS에 의한 국내산 해조류의 비소화학종 분석

Abstract

중금속은 인간의 건강을 위협하는 물질로 간주되면서 중요한 관리 대상이 되고 있다. 그러나 이러한 중금속들은 그 위험성 때문에 어떤 특정한 곳에 격리되어 있거나 인간과의 접촉이 차단된 채 존재하는 것이 아니라 지각의 운동, 지반의 침식작용, 화산활동 등을 통해 우리가 살아가는 자연환경에서 공기, 물, 토양 그리고 식품 등에 자연발생적으로 일정 농도 존재하며, 인간은 항상 이러한 환경에 노출되어 있다(1, 2). 더욱이 산업혁명 이후 광산개발, 석유화학공장에서의 배출, 농약과 살충제의 사용, 산업폐기물 및 도시 쓰레기에서의 유출 등 인간의 인위적인 활동 영역이 늘어나면서 암석이나 지각 등 내부에 여러 화합물 형태로 존재하던 각종 중금속들이 다량 배출되어 대기 및 농업환경 등을 오염시키고 있으며, 이러한 활동들이 결국 인간을 포함한 모든 생태계에 중대한 위협요소가 되고 있다(3, 4). 중금속의 위험성은 생물농축이라는 과정을 통해 큰 문제로 작용한다. 앞에서 언급한 자연발생적 이거나 인위적인 중금속의 배출은 물이라는 매개체를 통해 생태계의 1․2차 소비자인 육상․해양 생물들에 축적되고 이를 상위 포식자(중간 소비자)와 인간(최종 소비자)이 순차적으로 섭취하게 된다. 이러한 먹이사슬과 연관된 일련의 과정을 통해 생물농축이 일어나 인간의 체내에 잔류, 축적됨으로써 인간의 생리활성을 저해시키고, 간, 신장 등에 여러 가지 질병이나 암을 일으키는 등 위해한 영향을 끼치게 됨으로써 환경오염물질 중 가장 중요한 관리의 대상이 되고 있다(5). 특히 미국의 독성물질질병등록국(Agency for toxic substances and disease registry; ATSDR)과 환경보호국(Environmental protection agency; EPA)은 수퍼펀드(Superfund)라 불리는 포괄적환경대응책임보상법(Comprehensive Environmental Response, Compensation, and Liability Act, CERCLA, 1980)에 위험물질우선순위목록(Priority list of hazardous substances; Substance priority list; SPL)이라는 중금속 및 독성물질 등 인간에 위해한 물질들의 단순한 “독성의 세기”가 아닌 미국의 국가우선순위목록(National Priority List; NPL)의 인체 노출 가능성, 발생빈도, 독성 등 여러 조건의 고려하여 우선순위를 정해놓고 중요하게 관리하고 있다(6). 1974년 FAO/WHO 합동회의에서는 감시대상이 되는 화학적 오염물질 중 특히 중금속 오염물질로서 비소(As), 납(Pb), 수은(Hg), 카드뮴(Cd) 등을 우선순위로 다루면서, 세계 각국에서는 중금속에 의한 식품오염 현황을 조사하고 방지대책을 수립하기 시작하였으며, 이러한 사안에 대하여 UNEP/FAO/WHO (United Nations Environment Programme/ United Nations Food and Agriculture Organization/ World Health Organization)는 식품 오염에 관한 Monitoring Program (GEMS/FOOD)을 시행하여 Codex Alimentarius Commission에서 제정한 기준안과 연계하여 변화하는 국제적인 식품 오염 경향을 제시하고 있으며, 각 나라마다 상이한 기준 및 규격으로 인한 통상마찰 해결과 관련된 국제식품무역(International Food Trade)에 도움을 주고 있다. 해조류(seaweed)는 전 세계적으로 바다가 있는 곳 어디에서나 서식하고 있는 수산물이다. 전 세계적으로 약 6,000종, 식용으로는 150여종이(7), 한국에서만 약 500종이 발견되고, 식용으로는 50여종이 이용될 만큼 많은 종과 막대한 자원량이 파악되고 있어, 향 후 육상생물자원을 대체할 중요한 식량자원으로 주목받고 있다(8). 전 세계 해조류 생산량은 1990년대에 매년 평균 9.5%씩 증가하였고, 2000년대에는 7.4%씩 증가하여 1990년 380만 톤에서 2010년에 1,900만 톤으로 증가하였으며, 현재 연간 생산액으로는 약 57억 달러로 추정되고 있다. 생산되는 해조류 중 다시마, 유케마, 꼬시래기, 김, 미역과 같은 몇몇 종류의 특정 해조류가 전체 생산량의 약 83.7%를 차지하고 있다(Fig. 1). 또한, 단 31개국만이 해조류를 생산하고 있으며, 그 중 중국을 포함한 8개국에서 전체의 99.6%가 생산되고 있다. 나라별 생산량을 보면 중국이 1,109 만톤으로 전체의 58.4%를 차지하였으며, 그 뒤를 인도네시아 20.6% (391 만 톤), 필리핀 9.5% (180 만톤), 한국 4.7%( 901,700 톤), 북한 2.3% (444,300 톤), 일본 2.3% (432,800 톤), 말레이시아 1.1% (207,900 톤) 그리고 탄자니아가 0.7%(132,000 톤)를 차지하였다(9). 해조류는 바다의 채소(sea vegetable)로서 전통적으로 동아시아 지역인 한국, 중국, 일본에서 여러 음식의 재료로 이용되어 왔으며, 말레이시아나 인도네시아와 같은 동남아시아의 열대지역에서도 샐러드의 재료로서 이용되어 왔다. 그러나 유럽과 같은 서양에서는 해조류를 ‘seaweed’라고 하여 단지 바다에 서식하는 식물로 인식하였으며, 일부 해안가 지역에서 음식이나 가축의 사료 용도로만 이용되어졌다. 전 세계적으로 식품, 가공제품 등의 원료로 이용되는 주요 해조류는 김, 미역, 다시마, 톳, 큰실말, 모자반, 그리고 덜스(바닷말), 유케마코토니, 바다포도(Caulerpa lentillifera) 등 이다(10). 그러나 산업화가 진행되고 경제가 성장하면서 사람들은 건강과 장수에 대한 관심이 증가하였고, 특히 육식위주의 식사를 통해 성인병이 큰 문제로 대두되고 있는 서양인들에게 아시아 국가의 장수는 하나의 동경의 대상이 되면서 아시아의 식습관과 음식에 중요한 관심을 가지게 되었다. 해조류는 다른 식용식물 보다 풍부한 무기질을 함유하고 있어 우리 몸에 필요한 필수 무기질이나 미량 원소의 충족을 위해 식품 보조제로 추천된다(11). 또한 식품학적으로 해조류는 육상과 달리 염분의 과다, 높은 기압, 그리고 공기 중 보다는 희박한 산소 등의 열악한 환경에서 자라나는 특수성을 가지고 있어 새로운 물질의 존재 가능성이 기대되고 있으며(8), 실질적으로 항산화, 항균, 항암, 항응고, 항염증 등 여러 가지 활성이 연구되어지고 밝혀지면서 현재 많은 생리활성 물질들이 제품화되고 있다(12-16). 이러한 여러 가지 해조류 우수성과 이용 가능성을 인식하게 되면서 그 소비가 점차 증가하고 있다(10). 하지만 해조류가 사람들에게 건강식품으로 그리고 산업에서는 식품 및 의약품의 원료로써 이용이 증가하고 있는 상황에서, 해조류의 성장 특성상 자연발생적인 지각활동과 인위적인 인간의 생산활동에 의해 여러 형태의 화학종과 다양한 농도 범위의 중금속에 직․간접적으로 노출되는 바다라는 환경에 둘러싸여 있어 항상 잠재적 위해성을 가지고 있다. 특히 비소 함량의 경우 야채, 곡류, 육류 등의 육상 동․식물에서는 0.01～1.0 mg/kg의 범위로 존재하나, 해조류는 10～60 mg/kg의 비교적 높은 농도로 존재하고 있어 다른 중금속 보다 중요한 위해요인이 되고 있다(17-19). 특히 비소는 JECFA(72번째 회의)의 ‘식품 중 특정 오염물질의 평가’ 보고서에서 그 위해성을 규정하고 있으며(20), 미국의 EPA와 ATSDR에서는 비소를 위험물질우선순위목록(SPL)에 가장 첫 번째로 올려놓을 만큼 중요한 관리 대상이 되고 있다(Table 1). 또한 국제암연구소(IARC)에서는 비소중 무기비소를 1급 발암물질로 규정하고 있다(21, Table 2). 현재 우리나라 식품공전(22)의 식품원료기준에서 규제하고 있는 중금속은 비소, 카드뮴, 총수은, 메틸수은 및 납 등 5가지 항목이 있으며, 유럽이나 호주 등에도 비소를 포함한 여러 중금속들이 규제 대상이 되고 있다(Table 3). 그러나 현재 식품 중 비소에 대한 기준 규격은 캡슐류에서 1.5mg/kg 이하, 식염에서는 천일염 등 모든 제품에 대해 0.5 mg/kg 이하 그리고 가공식품에서는 식용유지류에서 0.1 mg/kg 이하로 설정되어 관리되고 있을 뿐(Table 4), 해조류 중의 비소함량에 대한 기준 및 규격은 아직까지 정해지지 않고 있는 실정이다. 이에 본 연구에서는 수산물 중 국내에 유통되고 있는 다소비 해조류를 대상으로 총비소 및 비소화학종의 분리․분석을 위해 ICP-MS와 HPLC-ICP-MS의 최적 분석조건을 설정하고, 실질적인 함량을 조사 하여 우리가 섭취하는 해조류의 안전성 기준 및 섭취 허용량 설정에 기초 자료를 제공하고자 한다.|Toxic heavy metals are threatening human health and therefore have been the subject of critical control. Seaweeds are exposed to heavy metals pollution in the sea, and at times may be potentially hazardous to human health. Therefore proper monitoring the contents of toxic heavy metals in sea foods such as seaweeds are required on regular basis. Arsenic has been ranked as significant risk substance by Agency for Toxic Substances and Disease Registry (ATSDR). Also based on sufficient evidences, the International Agency for Research on Cancer (IARC) suggested that inorganic arsenic compounds are skin and lung carcinogens in humans (Group 1).. However, in spite of such risks from arsenic both national and international standards and tolerable limits for majorly consumed foods such as seaweeds products are not optimized. Arsenic toxicity depends on the chemical form and its solubility and varies among animal species and with route of administration. So, it is also difficult to determine the toxicity from total arsenic content for seafoods like seaweeds without speciation. Therefore, development of analytical method for total arsenic and arsenic species in high arsenic concentrated foods like seaweeds is very much important. To analyze total arsenic by inductively coupled plasma-mass spectrometry (ICP-MS), different acid digestion methods of wet, wet-sonication and microwave were followed for sample preparation. For extraction methanol, ethanol and HNO3 solvents, for purification membrane filter and SPE cartridge and for separation mobile phase and anion-exchange column were applied and compared before analysis by HPLC-ICP-MS to reach the optimal conditions for arsenic speciation. The percentage recoveries of all digestion method were 96.7 to 99.3%. showing that all methods were appropriate for decomposition of the sample. However, microwave digestion method was the more optimal method, since the amount of acid solution and time used were lower and the possibility of external contamination during the decomposition was minimal. The ICP-MS technology has the advantages of selective removal of interfering substances at DRC mode and high sensitivity of MS for analysis of total arsenic contents. oxygen was chosen as the reaction gas with DRC mode because it reacts readily with As+ to form AsO+ (m/z=91). Samples should be extracted for analysis of the arsenic species without changing the form of the analytes. In order to compare the extraction efficiency, various solvents such as H2O, 50% methanol and 30% ethanol; in 1% HNO3 were applied to seaweeds. In each extraction solvent, the CRM (NRCC, DORM-2) was added to know the recovery of the certified values. The results from the analyses using HPLC-ICP-MS suggested that, 50% methanol (1% HNO3) were the best solvents for sample extraction purposes. The use of sample extracts for arsenic speciation through HPLC-ICP-MS, it cause problems like clogging of the column and the sample injection device and detector contamination. To prevent this phenomenon, the process of filtering is required. In this study, the comparative experiment was performed for verification of the filtering efficiency using the filtered CRM (NMIJ 7503-a) extracts with membrane filter and Oasis MAX cartridge (6 cc). Recovery of samples with SPE method were As(99.4%), DMA(103.1%) and As(101.8%) and with membrane filter method the results were not substantially different i.e. AsⅢ(91.8%), DMA(103.0%) and AsⅤ(104.5%). Therefore, both methods of membrane filter and SPE, could be used alternatively. Among he five arsenic species except for arsenobetaine (that is a zwitterion) has a range of different pH, depending on the form of the compound. Therefore in the alkaline mobile phase as anion, these has a range of dissociation constants suitable for anion-exchange column for separation. The gradient elution was controlled through mobile solution [A solution; ammonium bicarbonate (2 mM, pH 8.0), B solution; ammonium nitrate + ammonium phosphate (20 mM, pH 9.2)] to avoid duplication of detected peak on the chromatogram was used. A total of 348 seaweed samples of 5 different species from around South Korea were collected and analyzed for total arsenic by ICP-MS. And among them, 200 samples were analyzed for determination of arsenic speciation by HPLC-ICP-MS. The total arsenic content was determined from seaweed samples by ICP-MS and the results for laver (Porphyra tenera), Sea tangle (Laminaria japonica), sea mustard (Undaria pinnatifida), hijiki (Hizikia fusiforme), and gulf weed (Sargassum fulvellum) in a raw sample basis were 2.07, 3.07, 1.84, 4.49, and 6.48 mg/kg, respectively. For arsenic speciation, AsB and DMA were detected in laver, sea tangle and sea mustard and AsB (more than 85%) were the dominant species. But the AsC (as organic arsenic), AsⅢ and AsⅤ (as inorganic arsenic) were not identified. However, inorganic arsenics (AsⅤ and AsⅢ) and organic arsenics (DMA) were confirmed in gulf weed and hijiki samples, and AsⅤ is dominent arsenic sepcies in sargassum plants as 92.5% and 82.2%, respectively.