Action mechanism of anti-inflammatory peptides from Bacillus strain

Abstract

한국 전통식품으로부터 다약제 내성균주에 항균 효과를 보이는 펩타이드 생산 미생물을 분리하였으며 이 균주를 각각 Bacillus sp. CS61과 Bacillus sp. CS32라 명명하였다. 이 미생물이 생산하는 펩타이드는 항균, 항산화, 항염 효과를 나타내었다. Raw 264.7 대식세포는 LPS에 의해 일산화 탄소의 생성이 증가하는데 CS61과 CS32 균주가 생산하는 항균 펩타이드를 세포에 처리하였을 때 이의 생산을 억제하는 효과를 나타내었다. 또한 LPS에 의해 유도되는 염증 단백질인 iNOS, COX-2 단백질의 발현을 농도 의존적으로 감소 시킴을 확인하였다. 이들 항균 펩타이드가 일산화 탄소의 생성을 농도 의존적으로 억제함을 확인하고, 이 펩타이드가 염증 관련 경로인 MAP kinase에 어떠한 영향을 미치는지 western blotting을 통하여 분석하였다. CS61 균주가 생산하는 펩타이드는 전염증성 사이토카인의 분비를 조절하는extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK), p38 mitogen-activated protein (MAP) kinase 를 포함한 mitogen-activated protein (MAP) kinase의 인산화를 억제하였다. 또한, NF-κB는 외부로부터 자극이 주어지면 핵 내로 이동이 활성화 되어 염증을 유발하게 되는데CS61 펩타이드 처리 시 LPS에 의해 유도되는 NF-κB의 핵 내로의 이동 및 IκBα의 분해를 억제하였다. LPS에 의해 염증이 유도된 세포는 ERK, JNK, p38 MAPK의 인산화가 활성화 되는데 CS32 펩타이드는 이들의 인산화를 억제하였으며, NF-κB/IκBα 복합체의 안정화를 통해NF-κB의 활성과 IκBα의 분해를 억제하여 염증반응을 저해함을 하였다. Raw 264.7 세포는 LPS에 의해 iNOS, COX-2 단백질이 mitogen-activated protein (MAP) kinase 경로인 ERK, JNK, p38의 인산화에 의해서 활성화 되는데 CS61과 CS32 균주가 생산하는 항균 펩타이드는 Raw 264.7 세포에서 LPS에 의해 유도되는 염증 반응을 효과적으로 억제하는 효과가 있음을 확인하였다. CS32 균주가 생산하는 항균 펩타이드의 in vivo에서 항염증 효과가 있는지 확인하기 위하여 mouse ear edema 모델을 이용하였다. TPA로 마우스의 귀 부종을 유도하였으며 대조군으로 prednisolon을 사용하였다. TPA와 펩타이드를 함께 도포하여 항염증 효능을 확인한 결과 농도 의존적으로 부종이 억제 되었으며 귀조직의 iNOS 발현 또한 억제 됨을 확인하였다. 본 연구를 통하여 한국 전통 식품에서 분리한 바실러스가 생산하는 CS61, CS32 펩타이드는 항균 및 항염 효과를 나타내는 다 기능성 펩타이드임을 확인하였다.|To isolate effective antimicrobial peptides (AMPs) from a microbial source for the treatment of multidrug-resistant (MDR) bacteria, peptides were purified from Bacillus sp. CS61 and CS32 that were newly isolated from the traditional Korean fermented foods. Bacillus sp. CS61 and CS32 AMPs have potent inhibitory effects on lipopolysaccharide (LPS)-induced nitric oxide (NO) production in Raw 264.7 macrophage cells. Consistent with these findings, CS61 and CS32 AMPs suppress the expression of LPS-induced inducible nitric oxide synthase (iNOS) and cyclooxigenase-2 (COX-2) in a dose-dependent manner at the protein expression levels. Dose-dependent effects of AMPs on NO production, especially, focusing on its effects on the MAP kinases were investigated. CS61 AMP inhibited the phosphorylation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs), extracellular signal-regulated kinase (ERK1/2), c-Jun NH2-terminal kinase (JNK), and p38 mitogen-activated protein kinase (p38 MAPK), are involved in regulation of pro-inflammatory mediator secretion. Moreover, western blot analysis indicated that CS61 AMP inhibited completely LPS-triggered nuclear factor-κB (NF-κB) activation and IκBα degradation. CS32 AMP did not reduced activation of JNK MAP kinase but strongly reduced activation of phosphorylated ERK kinase and p38 MAP kinase. In addition, CS32 AMP treatment stabilized NF-κB/ IκBα complex and resulted in inhibition NF-κB activation and IκBα degradation. CS61 and CS32 AMPs seem exert its anti-inflammatory and immune modulatory properties to the molecules such as NO and iNOS/COX-2 by suppressing the activation of ERK and p38 MAP kinase, and NF-κB/ IκBα signal transduction pathways CS32 AMP was used to the TPA induced ear edema test, at the dose of 50 μg/ear evaluated the anti-inflammatory effect. CS32 AMP and prednisolone affect anti-inflammatory activity. CS32 AMP gives the highest contribution to the anti-inflammatory activity. Furthermore, I confirmed that the inhibition of CS32 AMP on iNOS expression in each ear by western blot analysis. Taken together, the results suggest that CS61 and CS32 AMPs are active anti-inflammatory constituents and that the anti-inflammatory property might be induced by the inhibition of iNOS and COX-2 expression from down-regulation of the ERK, JNK and p38 MAP kinase signal pathways and the inhibition of NF-κB activation.