RhBMP-2 모방 펩타이드가 융합된 삼차원 폴리카프로락톤 스캐폴드에 대한 조골모세포의 생물학적 거동

Abstract

골 형성 단백질 (Bone Morphogenetic Protein, BMP)은 골 형성에 직접적으로 관여하는 강력한 유도인자로서 탈무기질골 (demineralized bone matrix, DBM)이 이소성 골 형성 (ectopic bone formation)을 유도한다는 사실을 발견하여 BMP라 명명하였으며, 형질전환증식인자 (TGF-β) super family군에 속한다. 이중에서 핵심 펩타이드 서열은 골 재생의 관점에서 BMP의 활성을 모방할 수 있다. BMP-2의 아미노산 서열 중 기능성을 나타낸다고 알려져 있는 부위의 일부 아미노산인 73~92 아미노산 서열을 재조합하여 BMP-2 peptide (P24)를 합성하였다. 이러한 기술을 이용한 생체모방형 펩타이드는 그 본래의 활성은 그대로 유지하면서도 분자량이 적고 구조가 간단하여 안정하면서 취급이 간편하다는 장점을 가지고 있다. 본 연구에서는 플라즈마 표면개질로 중합된 3차원 폴리카프로락톤 (Polycaprolactone, PCL) 스캐폴드에 P24 펩타이드의 고정화에 의한 조골모세포의 부착과 증식 그리고 분화에 미치는 영향을 평가하였다. 3-D PCL 스캐폴드는 PCL을 90℃에서 용융하였으며, 노즐의 크기 300 µm, 플로터의 속도 220 mm/min, 압력 580 ± 10 MPa 적층조건에서 기공 크기 150 µm, 각각의 층이 이루는 각도는 45°이고, Fused Deposition Modeling (FDM) 방식으로 제작하였다. 저온 저압 RF 플라즈마 중합공정으로 PCL 스캐폴드 표면에 Poly acrylic acid (PAAc), Poly allylamine (PAAm), Poly 1,2-Diaminocyclohexane (DACH) 고분자박막을 코팅하였다. 중합처리 된 PCL 스캐폴드 표면 위에 P24 펩타이드를 고정화하여 표면 형상 및 조성을 FE-SEM (S-4800, Hitachi, Japan), ATR-FTIR (Nicolet 6700, Thermo electron, USA), XPS (VG Multilab 2000, ThermoVG Scientific, U.K), AFM (XE-100, Park systems, Korea)으로 분석하였으며, 플라즈마 세기에 따른 PCL 스캐폴드 표면에 존재하는 카르복실기와 아민기의 함량은 Toluidine Blue-O (TBO) 와 Methyl Orange (MO) 정량분석을 통하여 조사하였다. 시료표면의 친수성은 접촉각 (water contact angle, GS, Surface Tech Co. Ltd, Korea) 측정으로 확인하였다. 또한 조골모세포의 분화정도는 alkaline phosphatase (ALP)activity 활성도로 평가하였으며, 세포의 증식은 MTT assay, 세포 생존률과 독성평가를 하기 위하여 live/dead 염색법을 수행하였고, 세포형태를 확인하기 위하여 rhodamine-phalloidin 염색을 하였다. ATR-FTIR을 통해 아마이드 결합 및 아민기와 카르복실기가 존재함을 관찰하였으며, 샘플표면의 친수성은 아민기와 카르복실기 밀도에 영향을 미쳤다. PCL 표면에 rhBMP-2 모방 펩타이드가 고정화된 각각의 그룹은 FE-SEM, XPS 및 AFM을 이용하여 관찰한 결과, 형태와 위상학적인 변화를 관찰할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로, 플라즈마 중합반응으로 도입한 아민기 및 카르복실기는 생체활성물질을 고정화하는데 있어서 적절한 표면을 제공해주며, rhBMP-2 모방 펩타이드가 고정화된 그룹은 조골모세포와의 생체적합성이 적절한 표면임을 알 수 있었다. 또한 이러한 방법들은 향후 골 조직공학 및 생체재료의 기술개발에 응용이 가능할 것으로 사료된다.