Purification and Preliminary Crystal Structure Study of L-arabinose Isomerase from Thermophilic Alicyclobacillus acidoalcarius and Geobacillus kaustophilus HTA426

Abstract

다양한 미생물 내에서 존재하는L-arabinose isomerase (AI) 는 생체내에서 L-arabinose를 L-ribulose로 이성질화를 촉매하는 세포내 효소이며 또한 생체외 에서는 구조적 유사성 때문에 D-galactose를 D-tagatose로의 전환을 촉매할 수 있다. Tagatose 는 음식과 음료수내 식용향료로서 이용할 수 있는 드문 천연 당 일뿐만 아니라 약제와 화장품제조의 첨가제로도 이용될 수 있다. 현재 tagatose는 type-2 당뇨병과 비만 처방을 위한 강력한 약물이다. tagatose제조를 위해 확립된 몇몇 방법들 중에 가장 관심 있는 생물학적인 방법이 AI를 사용하는 효소를 이용한 과정이다. D-galactose의 D-tagatose로의 이성질화는 높은 온도를 필요로 하여 중온성세균의 AIs는 이용에 한계가 있다. 그래서, 고온성과 초고온성 세균은 tagatose 높은 생산율이 보고되어 있기 때문에 관심 있는 균들이다. 이중에 Geobacillus kaustophilus HTA426 와 Alicyclobacillus acidocaldarius 은 고온성 세균이고 생물공학적 관심 뿐만 아니라 기전을 확립하기 위해 결정구조를 조사하였다. 이 연구에서 G. kaustophilus HTA426 와 A. acidocaldarius으로부터 클론된 araA유전인자 단백질을 발현시켰고 Ni-NTA agarose를 이용하여 정제하였다. 이러한 균으로부터 AIs는 각각 GKAI, AAAI로 명명하고, 단백질을 x-ray crystallography에 의해 결정화하고 예비 데이터를 얻었다. 데이터 수집 결과 GKAI 결정은 asymmetric unit에 Matthew’s coefficient 가 2.25 Å3 Da-1 이고 solvent content가 45.39%와 함께 6개를 포함한 반면, AAAI결정은 Matthew’s coefficient 2.33 Å3 Da-1and solvent content 47.13%과 함께 9개를 포함하는 것으로 분석되었다. 현재는 AAAI와 GKAI의 3차원구조 결정은 MR과 model building에 의해 진행 중이다.|L-arabinose isomerase (AI) (EC 5.3.1.4), encoded by araA gene,is an intracellular enzyme in various microorganismsthat catalyzes the isomerization of L-arabinose to L-ribulose in vivo, it can also catalyze to conversion of D-galactose to D-tagatosein vitrodue to structural similarity of L-arabinose and D-galactose. Tagatose is a rare natural sugar which can be used as an edible sweetener in foods and beverages, or as an additive in pharmaceutical and cosmetic formulas. Currently, tagatose is a new potential drug for treating type-2 diabetes and obesity. Several methods have been established to manufacture tagatose, amongst them, an interesting biological method is enzymatic process usingAI. The isomerization of D-galactose to D-tagatose requires high temperature, mesophilic AIs therefore are of limited application. Thermophiles and hyperthermophiles are interesting strains, withthe obviously higher ratio of tagatose production’s yields were reported. Geobacillus kaustophilus HTA426 and Alicyclobacillus acidocaldarius are two of thermophilic strains which could be examined more about their AIs’ crystal structure to establish the catalytic mechanism as well as the biotechnological interest. In this study, the araA gene which were cloned from G. kaustophilus HTA426 and A. acidocaldarius were expressed and purified using Ni-NTA Agarose. The AIs from these strains, which denominated GKAI and AAAI respectively, were then crystallized and preliminary analyzed by X-ray crystallography. Data collections demonstrated that asymetric unit of the GKAI crystal contained six molecules, with Matthew’s coefficient 2.25 Å3 Da-1 and solvent content 45.39%, whilst asymetric unit of AAAI crystal contained nine molecules, with Matthew’s coefficient 2.33 Å3 Da-1 and solvent content 47.13%.The three-dimensional structure determination of AAAI and GKAI are currently in progress by molecular replacement and model building.