Platinum nanoparticles induce apoptosis in Raw 264.7 cells through p53-mitochondria pathway

Abstract

최근 백금나노입자(PNP)가 항산화 및 항염증 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다. 본 연구에서는 PNP05 (5 nm 크기) 또는 PNP30 (30 nm 크기)가 대식세포인 Raw 264.7 세포에 미치는 영향을 조사하였다. MTT 분석에 의하면 PNP는 Raw 264.7 세포에 강한 유독성을 보였고 입자 크기 의존적인 독성을 나타내었다. Annexin-V 및 PI 를 이용한 FACS 분석에 의하면 PNP는 Raw 264.7 세포의 증식을 억제하면서 세포사멸을 유도함을 확인할 수 있었다. 세포 증식억제에 대한 증거로 세포주기에 관련된 프로틴 (cyclin E1, cyclin D1, cyclin B1, Cdc2, cyclin A, cdk2, cdk4) 들의 발현감소, 그리고 세포사멸에 대한 증거들로 DNA 분절, western blotting에 의한 단절된 caspase-3/-7의 농도의존적 검출 등을 확인하였다. 흥미롭게도 2 µg/ml 농도의 PNP로 Raw 264.7 세포에 24 시간 처리한 경우에 cyclin E1, cyclin D1, cyclin B1, Cdc2의 발현이 농도의존적으로 감소한 반면 cyclin A, cdk2, cdk4들은 발현에는 큰 변화가 없었다. 그러나 6 µg/ml의 PNP 농도로 24 시간 처리한 경우에는 cyclin A, cdk2, cdk4의 발현도 역시 농도의존적으로 현저히 감소하였다. 또한 이들 단백들의 신호 조절 단백들인 p53 및 p21발현은 세포주기 억제 조건인 2 µg/ml 농도의 PNP 조건에서 농도의존적으로 증가하였으며 세포사멸 농도인 6 µg/ml의 PNP 농도에서는 더욱 현저히 증가되는 발현양상을 보였다. 이러한 결과는 Annexin-V를 이용한 분석 결과와도 일치하며 P53에 의한 초기 세포주기 억제기등이 고농도의 PNP조건에서 세포사멸로 전환되었음을 보여준다. 또한 농도의존적인 bcl-2 발현 감소, bax 발현 증가, 세포질에서의 cytochrome c 검출, caspase-9/-3 and -7의 활성화 등의 분자적 발현 증거들은 PNP에 의한 대식세포의 세포사멸 기전이 p53-mitochondrial 경로일 것임을 추정하게 해준다.|Platinum nanoparticles (PNPs) have been recently reported to have anti-oxidant and anti-inflammatory effects. In this study, we investigated the effects of PNPs on Macrophage cell line Raw 264.7 cells by exposing PNP05 (5 nm in size) or PNP30 (30 nm in size). The PNPs showed severe toxicity on Raw 264.7 cell in a MTT assay and the degree of toxicity was nano-particle size dependent. The growth and survival of Raw 264.7 cells were also dose-dependent. PNP-induced apoptotic evidence was observed in FACS analysis with the increased cell population binding to Annexin-V or PI. PNP-exposed cells exhibited DNA fragmentation with DNA laddering features, and apoptotic protein markers such as cleaved caspase-3/-7 were detected dose-dependently in Western Blotting. Western blotting of cell cycle related proteins revealed that the expression of cell cycle proteins were slightly decreased (cyclin D, cyclin E1, cyclin B1, Cdc2) or almost unchanged (cyclin A, cdk2, cdk4) at 2 µg/ml of PNP but further decreased at 6 µg/ml of PNP after 24 hours treatment. Furthermore, the cell cycle analysis by flow cytometry revealed that cell cycle was arrested at G2/M phase at low concentration of PNP (2 µg/ml). However, the arrest at G2/M phase was shifted into subG1 phase at high concentration of PNP (6 µg/ml). The expression of p53 and p21 which are necessary for maintaining a cell cycle arrest at G2/M phase were dramatically increased at apoptosis state. In addition, the expression of Bcl-2 protein was decreased and Bax was increased in a dose-dependent manner. Cytochrome c release from mitochondria to cytosol, after treating with PNPs, triggered the activation of caspase-9/-3 and -7. Overall our results suggest that PNP-induced apoptotic signaling may be involved in p53-mitochondrial pathway.