The regulatory mechanism of NBS1 by LAP2-α

Abstract

MRE11/RAD50/NBS1 (MRN) 복합체의 구성 요소 중 하나인 NBS1은 DNA 손상에 대한 반응과 염색체 무결성을 유지하는데 있어 중요한 역할을 하는 단백질이다. 일반적으로 NBS1 단백질 자체는 DNA 손상 복구 및 DNA 손상 신호 전달에 필요한 DNA 결합 및 kinase 활성을 갖고 있지 않지만 DDR에 관여하는 단백질들과 결합하여 DNA DSB의 접근성을 갖고 있으며, 중심 영역에 있는 세린/글루타민 모티프 (SQ motif)는 이온화 방사선에 반응하여 ATM ki-nase에 의해 인산화 되고, 이러한 인산화는 cell cycle checkpoint 컨트롤 및 텔로미어 유지에 있어서 중요한 역할을 한다. 그러나 DNA 손상 복구에서 NBS1의 정확한 기능은 완전히 밝혀지지 않았다. 본 연구에서는 이런 DNA 손상 반응에 중요한 역할을 하는 NBS1의 조절 기전을 좀 더 자세히 밝히고자, Yeast two-hybrid screening을 통해 NBS1과 결합하는 LAP2α (TMPO, Lamina-associated polypeptide (LAP)2α)라는 새로운 단백질을 동정하였다. 본 연구에서 우리는 DNA 손상 복구 반응에서 LAP2α가 어떠한 메커니즘을 통해 NBS1의 활성을 조절하는지에 대해 밝히고자 한다. 먼저 흥미롭게도 세포 내/외에서 방사선 조사 후 NBS1과 LAP2α의 결합이 증가함을 확인하였다. 이온화 방사선을 포함한 DNA 손상을 유도하는 시약 (HU, CPT, Olaparib)을 이용한 clonal survival을 통해 LAP2α의 기능 상실이 특히 이온화 방사선 (IR)에 의한 DNA손상 시 세포 민감도를 증가시킴을 확인하였다. 또한 γ-H2AX foci 염색을 통해 LAP2α의 감소가 DNA 손상 복구에 결함이 있음을 확인하였고 상동 재조합 활성 분석법을 통해서 LAP2α가 NBS1에 의존적인 경로를 통해 상동 재조합 활성을 조절하는 단백질 임을 확인하였다. 그리고 PLA assay를 통해 LAP2α가 DNA damage site로 모집 됨을 보았다. 우리는 LAP2α가 어떠한 메커니즘으로 NBS1과 함께 상호작용하여 DNA 손상 반응에 관여하는지에 알아보고자 몇가지 실험 방법으로 접근해 보았다. 먼저 NBS1과 LAP2α의 도메인 결실 돌연변이를 이용한 면역침강법으로 우리는 LAP2α가 NBS1의 BRCT2 domain과 결합하여 NBS1과 인산화 단백질 사이의 상호작용에 관여함으로써 DDR경로에서 역할을 수행할 수 있는 가능성을 확인하였다. 그리고 NBS1이 choromosome binding domain을 포함한 LAP2α specific region과 상호작용함으로써 DNA에 대한 접근성을 가질 수 있음을 확인하였다. 다른 접근으로 DNA 손상 반응에서 NBS1과 관련된 ATM-CHK2 경로에 LAP2α의 결핍이 어떠한 영향을 주는지에 대해 알아보고자 하였다. 웨스턴블랏 실험을 통해 ATM-CHK2 경로에 관련된 단백질의 발현 양에 대해 확인하였고 LAP2α의 결핍이 NBS1과 관련된 ATM-CHK2 경로에 영향을 주지 않음을 확인하였다. 그리고 단백질 변형과 관련된 메커니즘으로 접근해 보았다. DNA 손상 반응에 관련된 여러 단백질처럼 이온화 방사선에 의해 LAP2α가 인산화 되는지 확인해 보고자 하였다. 먼저 면역침강법을 통해 이온화 방사선으로 DNA 손상을 주었을 때 LAP2α의 인산화 여부를 확인하고자 하였고 LAP2α가 인산화 됨을 확인하였다. 추가로 LAP2α의 시퀀스 분석을 통해 LAP2α에 ATM 인산화 타겟 시퀀스가 있음을 알 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 LC-MS/MS분석을 진행하였지만 분석결과 이온화 방사선 처리 유무에 LAP2α의 인산화에 변화가 없음을 확인하였다. 따라서, 본 연구는 DNA 손상 반응에 있어서 상동 재조합 활성을 조절하는 새로운 조절 인자 LAP2α를 동정함과 동시에 LAP2α가 관여하는 NBS1의 새로운 조절 기전을 제시하는 바이다.|NBS1, one of the components of the MRE11 RAD50 NBS1 (MRN) complex, is a protein that plays an important role in responding to DNA damage and maintain-ing chromosomal integrity. However, the exact function of NBS1 in DNA damage recovery has not been fully identified. Here, we show that LAP2α interact to BRCT2 domain of NBS1. LAP2α (TMPO, Lamina-associated polypeptide (LAP) 2α) is a LEM (Lamina-associated polypeptideEMERIN MAN1) family protein known as nucleoplastic A-type Lamin and chromosome, but research on DNA damage recovery has not been sufficient. In this report, we show that depletion of LAP2α results in cellular hypersensitivity and impaired homologous recombi-nation to IR, as detected by clonal survival assay, late γ-H2AX foci staining and DR-GFP assay. We also found that LAP2α is recruited to DNA damage sites and phosphorylated after IR treatment. Thus, we suggested that LAP2α is a novel binding partner of NBS1 and a new DNA damage response regulator involved in DNA damage.