Regulatory mechanism of RIF1 through interaction with RBPMS

Abstract

RIF1 is downstream of 53BP1, promotes non-homologous end-joining (NHEJ) repair at DSBs (double strand breaks). In this study, we identify the RBPMS, is known RNA binding protein and mRNA processing factor, as a novel binding partner of RIF1 by yeast two-hybrid assay. RBPMS has been shown to selective marker of ganglion cells in the mammalian retina, but its function re-mains unknown in DNA damage response (DDR). We showed that RBPMS en-hanced its binding partner to RIF1 after ionizing radiation (IR). Depletion of RBPMS was resulted in cellular hypersensitivity and impaired DNA damage re-pair to IR, as detected by colony survival assay and late γ-H2AX staining. RBPMS-depleted cells were decreased the RIF1 foci to IR. However, we showed that a 53BP1 and BRCA1 damage focus are not significantly affected in RBPMS absence or presence condition. Furthermore, depletion of RBPMS was shown the decrease of non-homologous end-joining (NHEJ) and homologous-recombination (HR) repair activities. In addition, RAD51 foci were declined in deficient RBPMS cells. Thus, our combined results suggest a novel role for RBPMS in DSB repair through increase of NHEJ by association with RIF1. |DNA의 이중나선 절단 시 DNA는 상동결합재결합 또는 비 상동 말단결합으로 손상 복구가 이루어 진다. RIF1은 53BP1, Rev7, PTIP와 더불어 비 상동 말단 결합에 중요한 단백질로 알려져 있다. 본 연구에서는 Yeast two-hybrid screening을 통해 DNA 손상 복구에 필수적인 역할을 하는 RIF1과 결합하는 RBPMS 단백질을 동정하였다. RNA 결합 단백질인 RBPMS는 RRM(RNA Recognition Motif) family의 구성원으로써 세포의 전사와 mRNA processing에 관여한다. RBPMS는 세포 발달 및 성장을 조절하는데 매우 중요한 SMAD2/3 그리고 SMAD4를 통해 전사 활동을 촉진한다고 알려져 있다. 또한, RBPMS는 포유 동물의 망막에서 신경세포의 선택적인 마커로 알려져 있지만 DNA 손상 반응에서의 역할은 전무한 실정이다. 따라서 본 논문에서는 RBPMS가 RIF1과의 결합을 통해 RIF1 활성을 조절하는 기전을 밝힘으로써 RBPMS의 DNA 손상반응에서의 새로운 역할을 규명하고자 한다. 먼저, 방사선 조사 후 세포 내에서 RBPMS와 RIF1의 결합이 증가하는 것을 확인하였다. 이는 방사선 조사에 따른 DNA 이중나선 절단 복구에서 RIF1이 매개된 DNA손상 반응에 RBPMS가 기능적으로 연관됨을 시사한다. RBPMS의 결핍은 세포의 DNA손상 복구 활성을 떨어뜨림을 colony survival assay와 late γ-H2AX염색법을 통해 확인하였다. 다음으로, RBPMS가 RIF1의 활성 조절에 미치는 영향을 알아보기 위해 먼저 RBPMS가 결핍된 세포에서 방사선 조사 후 RIF1의 기능을 조사한 결과 RIF1의 DNA손상 foci가 감소되는 것을 각 단백질에 대한 면역염색을 통해 확인하였다. 그러나, 53BP1과 BRCA1 손상 foci는 RBPMS가 있고 없음에 큰 영향을 받지 않았다. 더 나아가, RBPMS의 결손에 의해 상동재결합, 비 상동 말단 결합 활성이 저하됨을 DR-GFP와 EJ5-GFP 벡터 시스템을 통해 확인하였다. 뿐만 아니라 RBPMS가 결핍된 세포에서 RAD51 foci가 감소됨을 확인하였다. 따라서, 본 연구는 RNA 대사 단백질로 알려진 RBPMS가 RIF1과의 결합을 통해 DNA 이중나선 절단 시 손상복구에 관여됨을 밝힌 최초의 보고이다.